D01:10.13374.isml001053x.2007.s2.58 第29卷增刊2 北京科技大学学报 Vol.29 SuppL 2 2007年12月 Journal of University of Science and Technology Beijing Dec.2007 Rhodococcus rhodochrous tg一A6腈水解酶 催化3氰基吡啶合成烟酸的研究 常雁红)吴芳)罗晖) )北京科技大学环境工程系.北京1000832)北京科技大学生物科学与技术系，北京100083 摘要利用高产腈水解酶的菌株Rhodococcus rhodochrous tg上A6催化3氰基吡啶合成烟酸，实验结果表明，腈水解酶的最 适底物浓度为130mmo/L.最适催化温度为55℃，最适pH值为pH7.0.经过15h连续补加底物3一氰基毗啶，反应体系中产 物烟酸的浓度可达到1652gL在产物浓度累积不高的情况下，菌体经过7批次（共67）的催化，烟酸的最终质量浓度累计 可达到529gL. 关键词晴水解酶：烟酸：3一氰基吡啶 分类号097 烟酸即吡啶一3一甲酸，又名尼可丁酸，维生素 NaCl1,K2HP042,MgS0402,琼脂20. B3,是一种结构简单、理化性质稳定的维生素，具有 产酶培养基组成(g/L):葡萄糖10，酵母膏3， 增强细胞新陈代谢、扩张血管、促进人体和动物生长 MgS040.5,K2HP04075,KHP040.75,诱导剂 发育的功能刂.工业上生产烟酸的传统方法是以3 7,谷氨酸钠10，pH7.5. 甲基吡啶(3-MP)、2甲基一5一乙基吡啶(MEP)及喹 主要仪器：TGL一16B型高速离心机.UV一2000 啉等为原料，通常需要在强酸（或强碱）、高温、高压 型紫外分光光度计，TGL一16G一A型高速冷冻离心 等反应条件下进行，而且副产物多、产量低、环境污 机，TH☑一D型台式恒温振荡器 染严重.而利用生物酶法水解转化氰基化合物，具 1.2菌株培养条件 有反应条件温和、可以实现一般化学转化所不具有 经过活化好的种子以6%的接种量接入产酶培 的优良的化学、区域和立体选择性，以及污染小的特 养基，产酶培养基的装液量为50mL,装入容积为 点冈.利用腈水解酶可高效催化3一氰基吡啶生成 300mL的三角瓶中，在28℃，于200r/min的台式 烟酸和氨，该方法过程简单，副产物少，反应条件温 恒温振荡器里培养120小时，然后离心收集菌体. 和，符合现代化工发展的趋势.生物转化法已受到 1.3酶活测定 人们的重视，有关报道日趋增多习，但目前国内未 取1mL的发酵液经12000r/min离心1min 见研究报道 后，用0.85%NaCl(w/v)溶液重悬，再经12000r/ 本论文旨在利用高产腈水解酶的微生物细胞直 min冷冻离心，用pH7.0的10mmo/L磷酸缓冲液 接催化3氰基吡啶合成烟酸，并对该游离细胞的催 重悬，在25℃水浴中预热2min,然后迅速加入一定 化特性进行了研究. 量的3一氰基吡啶溶液，振荡摇匀，并开始计时，反应 20mim后，用1mo/L的HC终止反应，经13000 1实验部分 r/min离心后，取上清液，用显色法测定酶催化反应 11菌种、培养基和主要仪器 生成的铵离子浓度9，在625nm波长下测吸光度 菌种为本实验室保藏的一株紫红红球菌 值，然后计算腈水解酶的酶活 Rhodococcus rhodochrous tgHA6. 酶活的定义：25℃下，每分钟催化3氰基吡啶 平板培养基组成(g/L):葡萄糖10，酵母粉3， 生成10mol烟酸所需的酶量为一个酶活单位 (U). 收稿日期：2007-10-14 基金项目：国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(No. 2结果与讨论 2007CB714304 作者简介：常雁红(1972-），女，副教授，博士 2.1底物浓度对酶活的影响 对于酶催化反应来说，不同的底物浓度对酶活
Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 腈水解酶 催化 3-氰基吡啶合成烟酸的研究 常雁红 1) 吴 芳 1) 罗 晖 2) 1) 北京科技大学环境工程系, 北京 100083 2) 北京科技大学生物科学与技术系, 北京 100083 摘 要 利用高产腈水解酶的菌株 Rhodococcus rhodochrous tg1 A6 催化 3-氰基吡啶合成烟酸, 实验结果表明, 腈水解酶的最 适底物浓度为 130 mmol/ L, 最适催化温度为 55 ℃, 最适 pH 值为 pH7.0 .经过 15 h 连续补加底物 3-氰基吡啶, 反应体系中产 物烟酸的浓度可达到 165.2 g/ L.在产物浓度累积不高的情况下, 菌体经过 7 批次( 共 67 h) 的催化, 烟酸的最终质量浓度累计 可达到 529 g/ L. 关键词 腈水解酶;烟酸;3-氰基吡啶 分类号 O 97 收稿日期:2007-10-14 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“ 973”项目) ( No . 2007CB714304) 作者简介:常雁红( 1972—) , 女, 副教授, 博士 烟酸即吡啶-3-甲酸, 又名尼可丁酸, 维生素 B3, 是一种结构简单、理化性质稳定的维生素, 具有 增强细胞新陈代谢、扩张血管 、促进人体和动物生长 发育的功能[ 1] .工业上生产烟酸的传统方法是以3- 甲基吡啶( 3-MP) 、2-甲基-5-乙基吡啶( M EP) 及喹 啉等为原料, 通常需要在强酸( 或强碱) 、高温、高压 等反应条件下进行, 而且副产物多、产量低、环境污 染严重 .而利用生物酶法水解转化氰基化合物, 具 有反应条件温和 、可以实现一般化学转化所不具有 的优良的化学、区域和立体选择性, 以及污染小的特 点 [ 2] .利用腈水解酶可高效催化 3-氰基吡啶生成 烟酸和氨, 该方法过程简单, 副产物少, 反应条件温 和, 符合现代化工发展的趋势 .生物转化法已受到 人们的重视, 有关报道日趋增多[ 3-5] , 但目前国内未 见研究报道. 本论文旨在利用高产腈水解酶的微生物细胞直 接催化 3-氰基吡啶合成烟酸, 并对该游离细胞的催 化特性进行了研究. 1 实验部分 1.1 菌种 、培养基和主要仪器 菌种为 本实 验室 保藏 的一 株紫 红红 球 菌 Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 . 平板培养基组成( g/L) :葡萄糖 10, 酵母粉 3, NaCl 1, K2HPO4 2, MgSO4 0.2, 琼脂 20 . 产酶培养基组成( g/L) :葡萄糖 10, 酵母膏 3, MgSO4 0.5, K2HPO4 0.75, KH2PO4 0.75, 诱导剂 7, 谷氨酸钠 10, pH 7.5 . 主要仪器:TGL-16B 型高速离心机, UV-2000 型紫外分光光度计, TGL-16G-A 型高速冷冻离心 机, THZ-D 型台式恒温振荡器 . 1.2 菌株培养条件 经过活化好的种子以 6 %的接种量接入产酶培 养基, 产酶培养基的装液量为 50 mL, 装入容积为 300mL 的三角瓶中, 在 28 ℃, 于 200 r/min 的台式 恒温振荡器里培养 120 小时, 然后离心收集菌体 . 1.3 酶活测定 取 1 mL 的发酵液经 12 000 r/min 离心 1 min 后, 用 0.85 %NaCl( w/ v) 溶液重悬, 再经 12 000 r/ min 冷冻离心, 用 pH 7.0 的 10 mmol/L 磷酸缓冲液 重悬, 在 25 ℃水浴中预热 2 min, 然后迅速加入一定 量的 3-氰基吡啶溶液, 振荡摇匀, 并开始计时, 反应 20 min 后, 用 1 mol/L 的 HCl 终止反应, 经13 000 r/min离心后, 取上清液, 用显色法测定酶催化反应 生成的铵离子浓度 [ 6] , 在 625 nm 波长下测吸光度 值, 然后计算腈水解酶的酶活. 酶活的定义 :25 ℃下, 每分钟催化 3-氰基吡啶 生成 1.0 μmol 烟酸所需的酶量为一个酶活单位 ( U) . 2 结果与讨论 2.1 底物浓度对酶活的影响 对于酶催化反应来说, 不同的底物浓度对酶活 第 29 卷 增刊 2 2007 年 12 月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol.29 Suppl.2 Dec.2007 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2007.s2.058
。224 北京科技大学学报 2007年增刊2 有较大影响.在本研究中，如图1所示，在底物浓度 (1)酶反应在一定的温度范围内，其速度随温度升高 较低时，反应速度随底物浓度增加而升高.在底物 而加快：(2)化学本质为蛋白质的酶，遇热易变性失 浓度为130mmol/L的条件下，Rhodococcus 去活性.温度对反应速度的影响是以上两种相反作 rhodochrous tg一A6腈水解酶的活力达到最高：而高 用综合的结果.在低于最适温度时，由于温度升高， 浓度的底物则抑制酶活，当底物浓度达到168 反应物的碰撞机率大大增强，反应速度增加：但高于 mmol/L以上，酶的活力仅为最高酶活时的70%. 最适温度时，酶蛋白的变性逐渐突出，反应速率随温 根据底物和酶的中间复合物学说7，在酶浓度恒定 度升高的效应将逐渐为酶蛋白变性效应所抵消，则 条件下，当底物浓度很小时，酶未被底物饱和，这时 反应速率迅速下降. 反应速率取决于底物浓度.当溶液中的酶全部被底 2.3酶的热稳定性 物饱和，反应达到最大反应速率.Mathew等用产 取菌体分别置于不同温度下保温，每隔1h测 睛水解酶的菌株R.rhodochrousJ1催化3氰基吡 定酶活，图3给出了该菌株腈水解酶的温度耐受性 啶转化烟酸时，也发现腈水解酶会受到高浓度底物 可以看出随着时间增加，温度越高，酶活的下降趋势 的强烈抑制作用，最终转化率很低.为获得高浓度 越快.本实验中，55℃时酶失活非常快，4h后，酶活 产物的酶催化反应，可以通过控制底物的浓度来克 只剩下3016%，而45℃时酶活的下降速率明显降 服底物的抑制作用，如周期性或连续性地向反应体 低，25℃时酶活则基本上保持稳定. 系中流加底物，使酶催化反应保持在恒定的低底物 因此，尽管55℃下测定酶活较高，但在实际催 浓度下进行8劉， 化过程中，为了长时间保持酶的催化效率，应在较低 120 温度下进行催化. 120 90 90F 60 60 30 ★25℃ ◆35℃ 30 ■45℃ 0 ●-55℃ 306090120150 3-氰基吡啶的浓度(mmol.L) 时间h 图】底物浓度对酶活的影响 图3腈水解酶的温度耐受性 因此，在实际催化过程中，底物3氰基吡啶的 最佳浓度为130mmo/L. 2.4pH值对初始酶活的影响 2.2温度对酶活的影响 pH值是影响酶催化性能的重要因素，A上 取菌体在不同温度下测定酶活，结果见图2.可 mataw ah等4发现，产耐热性腈水解酶的Bacillus 以看出，酶活随温度升高而逐渐增加，最佳催化温度 pallidus Dac521细胞在pH8.0时催化3氰基吡啶 为55℃当催化温度超过60℃随着温度的升高酶 的活力最佳：M athew等列用R.rhodochrous J1催 活迅速下降，在65℃酶活仅为最高时的19%.这主 化3-氰基吡啶发现其最适pH在8~9范围内.在 要因为温度对于酶的作用有两种不同的影响？： 本研究中，菌体分别重悬于不同pH的缓冲液中，初 120 始酶活测定结果如图4所示.可看出在pH4.5~ 90 7.0范围内酶活随pH升高而逐渐增加，在pH7.0 达到最高活性.该菌株的腈水解酶在pH6.0~9.0 60 范围内表现出较高且稳定的活性，相比其它腈水解 酶具有较宽的pH催化范围. 2.5酶对pH值的稳定性 菌体分别用不同pH的缓冲液重悬并置于25℃ 30 50 70 温度/℃ 水浴保温3h,测定其酶活，pH值的耐受性如图5所 示.在H4.5~9.0时酶活基本上都保持稳定，但 图2温度对酶活的影响 在偏酸性的条件下，随着pH值的下降酶活逐渐下
有较大影响 .在本研究中, 如图 1 所示, 在底物浓度 较低时, 反应速度随底物浓度增加而升高.在底物 浓 度 为 130 mmol/L 的 条 件 下, Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 腈水解酶的活力达到最高;而高 浓度的底物则抑 制酶活, 当底物浓 度达到 168 mmol/L 以上, 酶的活力仅为最高酶活时的 70 %. 根据底物和酶的中间复合物学说[ 7] , 在酶浓度恒定 条件下, 当底物浓度很小时, 酶未被底物饱和, 这时 反应速率取决于底物浓度 .当溶液中的酶全部被底 物饱和, 反应达到最大反应速率.Mathew 等[ 3] 用产 腈水解酶的菌株 R .rhodochrous J1 催化 3-氰基吡 啶转化烟酸时, 也发现腈水解酶会受到高浓度底物 的强烈抑制作用, 最终转化率很低 .为获得高浓度 产物的酶催化反应, 可以通过控制底物的浓度来克 服底物的抑制作用, 如周期性或连续性地向反应体 系中流加底物, 使酶催化反应保持在恒定的低底物 浓度下进行[ 8] . 图 1 底物浓度对酶活的影响 因此, 在实际催化过程中, 底物 3-氰基吡啶的 最佳浓度为 130 mmol/L . 图 2 温度对酶活的影响 2.2 温度对酶活的影响 取菌体在不同温度下测定酶活, 结果见图2 .可 以看出, 酶活随温度升高而逐渐增加, 最佳催化温度 为55 ℃, 当催化温度超过 60 ℃, 随着温度的升高酶 活迅速下降, 在 65 ℃酶活仅为最高时的 19 %.这主 要因为温度对于酶的作用有两种不同的影响[ 7] : ( 1) 酶反应在一定的温度范围内, 其速度随温度升高 而加快;( 2) 化学本质为蛋白质的酶, 遇热易变性失 去活性 .温度对反应速度的影响是以上两种相反作 用综合的结果 .在低于最适温度时, 由于温度升高, 反应物的碰撞机率大大增强, 反应速度增加;但高于 最适温度时, 酶蛋白的变性逐渐突出, 反应速率随温 度升高的效应将逐渐为酶蛋白变性效应所抵消, 则 反应速率迅速下降 . 2.3 酶的热稳定性 取菌体分别置于不同温度下保温, 每隔 1 h 测 定酶活, 图 3 给出了该菌株腈水解酶的温度耐受性, 可以看出随着时间增加, 温度越高, 酶活的下降趋势 越快.本实验中, 55 ℃时酶失活非常快, 4 h 后, 酶活 只剩下 30.16 %, 而 45 ℃时酶活的下降速率明显降 低, 25 ℃时酶活则基本上保持稳定 . 因此, 尽管 55 ℃下测定酶活较高, 但在实际催 化过程中, 为了长时间保持酶的催化效率, 应在较低 温度下进行催化. 图3 腈水解酶的温度耐受性 2.4 pH 值对初始酶活的影响 pH 值是 影响酶 催化性 能的重 要因素, Almataw ah 等[ 4] 发现, 产耐热性腈水解酶的 Bacillus pallidus Dac521 细胞在 pH 8.0 时催化 3-氰基吡啶 的活力最佳 ;M athew 等 [ 3] 用 R .rhodochrous J1 催 化 3-氰基吡啶发现其最适 pH 在 8 ～ 9 范围内 .在 本研究中, 菌体分别重悬于不同 pH 的缓冲液中, 初 始酶活测定结果如图 4 所示 .可看出在 pH 4.5 ～ 7.0 范围内酶活随 pH 升高而逐渐增加, 在 pH 7.0 达到最高活性.该菌株的腈水解酶在 pH 6.0 ～ 9.0 范围内表现出较高且稳定的活性, 相比其它腈水解 酶具有较宽的 pH 催化范围. 2.5 酶对 pH 值的稳定性 菌体分别用不同pH 的缓冲液重悬并置于 25 ℃ 水浴保温 3 h, 测定其酶活, pH 值的耐受性如图 5 所 示 .在 pH 4.5 ～ 9.0 时酶活基本上都保持稳定, 但 在偏酸性的条件下, 随着 pH 值的下降酶活逐渐下 · 224 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2007 年 增刊 2
Vol.29 Suppl.2 常雁红等：Rhodococcus rhodochrous tg上A6腈水解酶催化3子氰基吡啶合成烟酸的研究 225。 降，Mathew等刭和Almataw ah等号也发现在较低 性增强的效果略大于产物对酶的抑制作用，所以酶 pH下腈水解酶的活力急速降低.Rhodococcus 活略有上升.但当烟酸浓度继续上升后，抑制作用 rhodochrous tg一A6菌的腈水解酶在偏碱性条件下， 使酶活逐步下降，当烟酸浓度达到820mmo/L时. 酶的活力随着pH值的增加缓慢下降，在pH7.0时 酶活只是初始酶活的49.54%. 酶的稳定性最好 2.7连续催化 110 底物和（或产物的抑制作用会大大降低酶的催 化活性.本实验考察了最高产物累积浓度对酶活的 90 影响. 取50mLpH7.0磷酸缓冲液，加入一定的菌 体，保持温度为28℃磁力搅拌.逐次加入3-氰基 50 吡啶，使得3-氰基吡啶浓度保持在130mmo/L,同 30 时监测反应体系中烟酸含量的变化（见图7），经过 10 PH 15h的连续催化，烟酸的质量浓度累积达到165.2 g/L(1.34mo/L),转化率为100%.但在高产物浓 图4pH值对酶活的影响 度积累的情况下，剩余酶活很少（酶活仅为初始时的 11.91%,基本无法再次利用. 780 100 160 ●烟酸 ★3-氰基吡啶 ●● 3 60 120 40 80F 40 20 60 4 0 8 12 pH 16 时间h 图5酶对pH值的耐受性 图7连续催化实验的产物累积浓度 2.6产物浓度对细胞酶活的影响 为了提高酶的催化效率，如果在产物浓度较低 在许多酶的催化过程中，高浓度产物会对酶有 的条件下(50~90g/L),及时将菌体和产物进行分 抑制作用.在本研究中，考察了不同烟酸浓度对细 离，则菌体可以进行七个批次的连续催化反应（见图 胞酶活的影响，结果见图6.在烟酸浓度50~700 8),烟酸的质量浓度累计达到529g/L(4.30mo/ mmo/L范围内，腈水解酶的酶活较为稳定，甚至当 L),可以大大提高菌体的使用效率. 烟酸浓度为400mmo/L时，酶活达到初始酶活的 100 106.06%.这可能是由于产物浓度增加后，细胞的 80 通透性增强，促进了底物和产物的扩散，使酶催化速 60 度加快.虽然产物对酶有抑制作用，但细胞的通透 120 100 68101214 时间h The first batch ●The second batch◆The third batch 80L -The fourth batch-The fifth batch -The sixth batch 量-The seventh batch 601 图8分批连续催化实验的产物累积浓度 150300450600750 3结论 烟酸浓度(mmol.L) 采用高产腈水解酶的菌株Rhodooccus 图6烟酸浓度对酶活的影响
降, M athew 等 [ 3] 和 Almataw ah 等 [ 4] 也发现在较低 pH 下腈 水解 酶的 活力 急速 降 低.Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 菌的腈水解酶在偏碱性条件下, 酶的活力随着 pH 值的增加缓慢下降, 在 pH 7.0 时 酶的稳定性最好 . 图 4 pH 值对酶活的影响 图 5 酶对 pH 值的耐受性 图 6 烟酸浓度对酶活的影响 2.6 产物浓度对细胞酶活的影响 在许多酶的催化过程中, 高浓度产物会对酶有 抑制作用.在本研究中, 考察了不同烟酸浓度对细 胞酶活的影响, 结果见图 6 .在烟酸浓度 50 ～ 700 mmol/L 范围内, 腈水解酶的酶活较为稳定, 甚至当 烟酸浓度为 400 mmol/ L 时, 酶活达到初始酶活的 106.06 %.这可能是由于产物浓度增加后, 细胞的 通透性增强, 促进了底物和产物的扩散, 使酶催化速 度加快 .虽然产物对酶有抑制作用, 但细胞的通透 性增强的效果略大于产物对酶的抑制作用, 所以酶 活略有上升.但当烟酸浓度继续上升后, 抑制作用 使酶活逐步下降, 当烟酸浓度达到 820 mmol/ L 时, 酶活只是初始酶活的 49.54 %. 2.7 连续催化 底物和( 或) 产物的抑制作用会大大降低酶的催 化活性 .本实验考察了最高产物累积浓度对酶活的 影响. 取 50 mL pH 7.0 磷酸缓冲液, 加入一定的菌 体, 保持温度为 28 ℃, 磁力搅拌.逐次加入 3-氰基 吡啶, 使得 3-氰基吡啶浓度保持在 130 mmol/L, 同 时监测反应体系中烟酸含量的变化( 见图 7) , 经过 15 h 的连续催化, 烟酸的质量浓度累积达到 165.2 g/L( 1.34 mol/L) , 转化率为 100 %.但在高产物浓 度积累的情况下, 剩余酶活很少( 酶活仅为初始时的 11.91 %) , 基本无法再次利用. 图 7 连续催化实验的产物累积浓度 为了提高酶的催化效率, 如果在产物浓度较低 的条件下( 50 ～ 90 g/L) , 及时将菌体和产物进行分 离, 则菌体可以进行七个批次的连续催化反应( 见图 8) , 烟酸的质量浓度累计达到 529 g/ L( 4.30 mol/ L) , 可以大大提高菌体的使用效率. 图 8 分批连续催化实验的产物累积浓度 3 结论 采 用 高 产 腈 水 解 酶 的 菌 株 Rhodococcus Vol.29 Suppl.2 常雁红等:Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 腈水解酶催化 3-氰基吡啶合成烟酸的研究 · 225 ·
。226 北京科技大学学报 2007年增刊2 rhodochrous tg一A6催化3氰基吡啶合成烟酸，考 【习罗积杏，薛建萍，沈寅初.。腈水解酶产生菌游离细胞催化特性 察了底物浓度、温度H值、产物浓度等因素对腈水 的初步研究.工业微生物.2006.36(4)：13 3 Mathew C D,Nagasawa T,Kobayashi M,et al.Nitrilase-cat- 解酶催化的影响.研究结果表明：酶在底物浓度为 alyzed production of nicotinic acid from 3-eyanopy ridine in 130mmo/L,55℃和pH7.0条件下表现出最高催 Rhalococus rhodchrous J1.Appl Environ Microbiol,1988.54 化活性，但菌体在实际催化中需在较低温度(25○ (4)±1030 下进行，以保持酶活的稳定性.在持续补加底物3 [4 Amatawah Q A,Cow an D A.Themostabe nitrilase catalysed 氰基吡啶的条件下，经过15h的催化，反应液中产 production of nicotinie acid from 3cyanopy ridine.Enzyme Mi- crob Technol,1999,25:718 物烟酸的浓度可达到165.2g/L:在产物浓度累积不 [5]Vaughan P A.Kmow les C J.Cheetham P S J.Conversion of 高的情况下，分离后的菌体可进行多批次催化，经过 cyanopy ridine to nicotinie acid by Nocardia rhodchrous LL100 7批次（共67小时）的催化，产物烟酸的最终质量浓 21.Enzyme Microb Technal,1989,11:815 度累计可达到529g/L.此项研究为菌株Rhodocc- [6 Faw cett JK.Scat JE.A rapid and precise method for the deter cus rhodochrous tg一A6的工业化应用打下了良好的 mination of u rea.Clin Path,1960,13:156 基础. 【刀王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学（上册），第3版.北京：高等 教有出版社，2002.355-355：378 参考文献 [习娄文勇，宗敏华，刘森林.微生物酶催化腈水解反应的研究进 展.微生物学通报，2001,28(6：76 [刂李艳云，尹振晏，宫彩红，等.烟酸的研究进展.北京石油化工 学院学报，2006,141)：59 Conversion of 3-cyanopyridine to nicotinic acid by nitrilase in Rhodococcus rhodochrous tg一A6 CHANG Yanhong,WU Fang",LUO Hui2) 1)Department of Envimnmental Engineering University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083.China 2)Department of Biological Science and Techmlogy,University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083.China ABSTRACT The strain of Rhodococcus rhodochrous tgHA6 with high activity of nitrilase w as used to co nvert 3-cyanopyridine to nicotinic acid.By using resting cells,the optimum substrate concentration was 130mmol/L, and the optimized temperature and pH were 55 Cand 7.0,respectively.Under the optimal conditions,100% of the added 3-cy anopy ridine could be converted,and the highest concentrat ion of nicotinic acid in reaction mix- ture achieved 165.2g/L at 15h.In case of higher yield,the resting cells could be reused for seven batches cat- aly zing total 67h),and the summed yield of nicotinic acid could reach 529g/L. KEY WORDS nitrilase;nicotinic acid;3-cy anopy ridine
rhodochrous tg1-A6 催化 3-氰基吡啶合成烟酸, 考 察了底物浓度、温度 、pH 值、产物浓度等因素对腈水 解酶催化的影响.研究结果表明:酶在底物浓度为 130 mmol/L, 55 ℃和 pH 7.0 条件下表现出最高催 化活性, 但菌体在实际催化中需在较低温度( 25 ℃) 下进行, 以保持酶活的稳定性.在持续补加底物 3- 氰基吡啶的条件下, 经过 15 h 的催化, 反应液中产 物烟酸的浓度可达到 165.2 g/L ;在产物浓度累积不 高的情况下, 分离后的菌体可进行多批次催化, 经过 7 批次( 共 67 小时) 的催化, 产物烟酸的最终质量浓 度累计可达到 529 g/L .此项研究为菌株 Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 的工业化应用打下了良好的 基础 . 参 考 文 献 [ 1] 李艳云, 尹振晏, 宫彩红, 等.烟酸的研究进展.北京石油化工 学院学报, 2006, 14( 1) :59 [ 2] 罗积杏, 薛建萍, 沈寅初.腈水解酶产生菌游离细胞催化特性 的初步研究.工业微生物, 2006, 36( 4) :13 [ 3] M athew C D, Nagasawa T, Kobayashi M, et al.Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3 -cyanopy ridine in Rhodococcus rhodochrous J1.Appl Environ Microbiol, 1988, 54 ( 4) :1030 [ 4] Almatawah Q A, Cow an D A.Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine.Enzyme Microb Technol, 1999, 25:718 [ 5] Vaughan P A, Know les C J, Cheetham P S J .Conversi on of 3- cyanopy ridine to nicotinic acid by Nocar dia rhodochrous LL100- 21.Enzyme Mi crob Technol, 1989, 11:815 [ 6] Faw cett J K, Scott J E .A rapid and precise method f or the determination of u rea .Clin Path, 1960, 13:156 [ 7] 王镜岩, 朱圣庚, 徐长法.生物化学( 上册) , 第 3 版.北京:高等 教育出版社, 2002, 355-355:378 [ 8] 娄文勇, 宗敏华, 刘森林.微生物酶催化腈水解反应的研究进 展.微生物学通报, 2001, 28( 6) :76 Conversion of 3-cyanopyridine to nicotinic acid by nitrilase in Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 CHANG Y anhong 1) , WU Fang 1) , LUO Hui 2) 1) Department of Environment al Engineering University of S cience and Technology Beijing, Beijing 100083, China 2) Department of Biological Science and Technology, University of S cience and Technology Beijing, Beijing 100083, China ABSTRACT The strain of Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 w ith high activity of nitrilase w as used to co nvert 3-cyanopyridine to nico tinic acid .By using resting cells, the optimum substrate concentration w as 130 mmol/L, and the optimized temperature and pH w ere 55 ℃and 7.0, respectively .Under the optimal conditions, 100 % of the added 3-cy anopy ridine could be converted, and the highest concentration of nico tinic acid in reaction mixture achieved 165.2 g/L at 15 h .In case of higher yield, the resting cells could be reused for seven batches cataly zing ( total 67 h) , and the summed yield of nicotinic acid could reach 529 g/L . KEY WORDS nitrilase ;nicotinic acid ;3-cy anopy ridine · 226 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2007 年 增刊 2