公式,即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280-0.74×A260(mg/ml) 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵 母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。 3.215nm与225nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280m的光吸收测定时,可用215nm与 225nm吸收值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度 用已知浓度的标准蛋白质,配制成20~100μg/m的一系列s0ml的蛋白质溶液, 分别测定215nm和225nm的吸光度值,并计算出吸收差 吸收差A=A215-A25 以吸收差Δ为纵座标,蛋白质浓度为横座标,绘出标准曲线。再测出未知样品的吸 收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度 本方法在蛋白质浓度20-100μg/ml范围内,蛋白质浓度与吸光度成正比,NaCl、 (NH4)2SO4以及01M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液,都无显著干扰作用,但是0. IN NaOH, 01M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大,必须将其 浓度降到0.005M以下才无显著影响 4.肽键测定法 蛋白质溶液在238m处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋 白质溶液配制一系列50~500ug/m已知浓度的50ml蛋白质溶液,测定238mm的光吸收 值A238,以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标,绘制出标准曲线。未知样品的浓度即 可由标准曲线求得。 进行蛋白质溶液的柱层析分离时,洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。 本方法比280mm吸收法灵敏。但多种有机物,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类 和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐,无机碱和水溶液进行测定。若含有有 机溶剂,可先将样品蒸干,或用其他方法除去干扰物质,然后用水、稀酸和稀碱溶解后 再作测定。 参考文献 I, Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, 55-59n1 2、蔡武成、袁厚积主编:生物物质常用化学分析法,1982年,93~99页 3、张龙翔、张庭芳、李令媛等编著,生化实验方法和技术,1981年,164~-169 页,高等教育出版社 4 Bradford M. Anal Biochem, 72, 248(1976) 180180 公式,即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280-0.74×A260 (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵 母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm 与 225nm 的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm 的光吸收测定时,可用 215nm 与 225nm 吸收值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质,配制成 20~100 g/ml 的一系列 5.0ml 的蛋白质溶液, 分别测定 215nm 和 225nm 的吸光度值,并计算出吸收差: 吸收差= A215 -A225 以吸收差为纵座标,蛋白质浓度为横座标,绘出标准曲线。再测出未知样品的吸 收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 本方法在蛋白质浓度 20~100g/ml 范围内,蛋白质浓度与吸光度成正比,NaCl、 (NH4)2SO4 以及 0.1M 磷酸、硼酸和 Tris 等缓冲液,都无显著干扰作用,但是 0.1N NaOH, 0.1M 乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的 215nm 光吸收值较大,必须将其 浓度降到 0.005M 以下才无显著影响。 4. 肽键测定法 蛋白质溶液在 238nm 处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋 白质溶液配制一系列 50~500g/ml 已知浓度的 5.0ml 蛋白质溶液,测定 238nm 的光吸收 值 A238,以 A238 为纵座标, 蛋白质含量为横座标,绘制出标准曲线。未知样品的浓度即 可由标准曲线求得。 进行蛋白质溶液的柱层析分离时,洗脱液也可以用 238nm 检测蛋白质的峰位。 本方法比 280nm 吸收法灵敏。但多种有机物,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类 和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐,无机碱和水溶液进行测定。若含有有 机溶剂,可先将样品蒸干,或用其他方法除去干扰物质,然后用水、稀酸和稀碱溶解后 再作测定。 参考文献 1、Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, 55-59 页 2、蔡武成、袁厚积主编:生物物质常用化学分析法,1982 年,93~99 页 3、张龙翔、张庭芳、李令媛等编著,生化实验方法和技术,1981 年,164~169 页,高等教育出版社 4、Bradford M.Anal Biochem ,72,248(1976)