6叶绿体色素的提取分离及理化性质叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，叶绿体色素是植物吸收光能，进行光合作用的重要物质，主要含有叶绿素（叶绿素a，叶绿素b）、类胡萝卜素（胡萝下素和叶黄素）等光合色素，这些色素具有不同的化学组成、结构及理化性质，在光合作用中执行不同的功能，实验目的1掌握叶绿体色素提取和分离的方法及其原理。2.了解叶绿体色素的物理化学性质。实验材料与用品1.新鲜材料：菠菜（Spinaciaoleracea）等植物叶片。2．实验用品：天平，研钵，剪刀，试剂瓶，漏斗，底、盖直径相同的培养血，平底短玻管，分光镜，色层分析滤纸，刻度试管，试管架，玻棒，滴管，烧杯、酒精灯，石棉网等。3.试剂：石英砂，95%乙醇，碳酸钙，推动剂（石油醚：丙酮：苯的体积比为10:2：1),20%KOH-甲醇溶液(20克KOH溶于100ml甲醇中)5%的稀盐酸，蒸馏水，醋酸铜结晶，醋酸-醋酸铜溶液（取醋酸铜15克溶于100ml冰醋酸中，蒸馏水定容至1000ml)等。实验原理、内容与方法1.叶绿体色素的提取叶绿体中含有叶绿素和类胡萝卜素两大类色素，它们与类囊体膜蛋白质结合形成色素蛋白复合体。叶绿体色素不溶于水，而溶于有机溶剂叶绿素以亲水部分与蛋白质结合，亲脂部分与类脂结合，纯的有机溶剂不能打破色素与蛋白质的结合，所以必须用能与水混溶的乙醇、丙酮等有机溶剂，在少量水存在的情况下把叶绿体色素提取出来。G将新鲜叶片称取5克，洗净擦干，剪去叶柄、中脉后剪碎放入研钵内，加入少量石英砂和碳酸钙；加入5毫升95%的乙醇迅速研磨成匀浆，再加入10-15毫升95%乙醇，过滤于棕色试剂瓶中，滤液为叶绿体色素粗提液，避光保存备用。2.叶绿体色素的分离分离色素的方法很多，其中纸层析法简便易行。因吸附剂对不同物质的吸附能力不同，当用适当的溶剂推动时，色素混合物随同溶剂在层析滤纸上流过，不同色素在两相（固定相和流动相）间的分配系数不同，所以移动速度不同，经过一段时间层析后，使不同色素得以分离。取一张色层分析用滤纸，在中心打一个圆形小孔，另取一张5-10cm长，1.5-3cm宽
6 叶绿体色素的提取分离及理化性质 叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，叶绿体色素是植物吸收光能， 进行光合作用的重要物质，主要含有叶绿素（叶绿素 a，叶绿素 b）、类胡萝卜 素（胡萝卜素和叶黄素）等光合色素，这些色素具有不同的化学组成、结构及 理化性质，在光合作用中执行不同的功能。 实验目的 1. 掌握叶绿体色素提取和分离的方法及其原理。 2. 了解叶绿体色素的物理化学性质。 实验材料与用品 1．新鲜材料：菠菜（Spinacia oleracea）等植物叶片。 2．实验用品：天平，研钵，剪刀，试剂瓶，漏斗，底、盖直径相同的培养皿，平底短 玻管，分光镜，色层分析滤纸，刻度试管，试管架，玻棒，滴管，烧杯、酒精灯，石棉网等。 3．试剂：石英砂, 95%乙醇, 碳酸钙, 推动剂(石油醚:丙酮:苯的体积比为 10:2:1), 20％ KOH-甲醇溶液(20 克 KOH 溶于 100 ml 甲醇中), 5%的稀盐酸, 蒸馏水, 醋酸铜结晶, 醋酸 -醋酸铜溶液(取醋酸铜 15 克溶于 100ml 冰醋酸中，蒸馏水定容至 1000ml)等。 实验原理、内容与方法 1．叶绿体色素的提取 叶绿体中含有叶绿素和类胡萝卜素两大类色素，它们与类囊体膜蛋白质结合形成色素蛋 白复合体。叶绿体色素不溶于水，而溶于有机溶剂叶绿素以亲水部分与蛋白质结合，亲脂部 分与类脂结合，纯的有机溶剂不能打破色素与蛋白质的结合，所以必须用能与水混溶的乙醇、 丙酮等有机溶剂，在少量水存在的情况下把叶绿体色素提取出来。 ) 将新鲜叶片称取 5 克，洗净擦干，剪去叶柄、中脉后剪碎放入研钵内，加入少量石英 砂和碳酸钙；加入 5 毫升 95%的乙醇迅速研磨成匀浆，再加入 10-15 毫升 95%乙醇，过滤于 棕色试剂瓶中，滤液为叶绿体色素粗提液，避光保存备用。 2．叶绿体色素的分离 分离色素的方法很多，其中纸层析法简便易行。因吸附剂对不同物质的吸附能力不同， 当用适当的溶剂推动时，色素混合物随同溶剂在层析滤纸上流过，不同色素在两相（固定相 和流动相）间的分配系数不同，所以移动速度不同，经过一段时间层析后，使不同色素得以 分离。 ) 取一张色层分析用滤纸，在中心打一个圆形小孔，另取一张 5-10cm 长，1.5-3cm 宽
的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度限制在0.5cm以内），风干，重复4-5次，风干后沿长度方向卷成纸抢，将纸抢的点样端插入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤纸平齐。取一个培养血（直径略小于滤纸），中央放一短玻管，管内放1/3-1/2的推动剂，将插有滤纸的纸抢下端插入盛有推动剂的短玻管中，迅速盖上相同直径的培养皿盖，放于弱光下或暗处，纸抢籍毛细管作用吸收溶剂，溶于溶剂中的色素随之向四周扩散，不久在滤纸上得到各种色素的同心圆环：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。在滤纸上标出色素环的名称。问题与思考（1）研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量碳酸钙有何作用？多加可能出现什么问题？（2）实验中用纸层析法分离色素时，应注意哪些操作事项？3.荧光现象叶绿体色素分子吸收光量子后，分子内的电子跃迁而变为激发态，因激发能未被适当的受体接受，被激发的电子又迅速回复到原来的能量水平，释放的能量除一部分转变为热能外，常释放出比原来吸收光的波长更长的荧光或磷光，因此可观察到叶绿体色素提取液的反射光为暗红色，这种现象称为荧光现象。?取叶绿体色素提取液4毫升置于10毫升试管中（如果太浓可加少量95%乙醇进行稀释），在直射光下，分别对着光源、背着光源观察叶绿体色素提取液的颜色。4.叶绿素的皂化作用叶绿素是一种双羧酸的酯类物质，能与碱发生皂化反应而生成叶绿酸的盐，形成盐后，其亲水性大大加强，可溶于水中，用这一方法可将叶绿素和类胡萝卜素分开。取观察过荧光现象的4毫升叶绿体色素提取液，加入1毫升20%KOH-甲醇溶液，充分摇勾。静置片刻，再加入5毫升苯，混匀后，用滴管沿试管壁慢慢加入1毫升蒸馏水，静置，可见溶液慢慢分为三层，上层是苯溶液，其中溶有胡萝下素及叶黄素：下层是乙醇溶液，其中溶有已皂化的叶绿素a、b及少量叶黄素。试管底部同时出现白色沉淀（这是细胞蛋白质产生的乳化现象）。另取4毫升叶绿体色素提取液，直接加入5毫升苯和1毫升蒸馅水，结果如何？5.叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱叶绿素和类胡萝卜素具有不同的光学特性，它们的吸收光谱可用分光镜检查或用分光光度计精确测定，叶绿素吸收红光和兰紫光，类胡萝下素吸收兰紫光
的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度 限制在 0.5cm 以内），风干，重复 4-5 次，风干后沿长度方向卷成纸捻，将纸捻的点样端插 入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤纸平齐。取一个培养皿（直径略小于滤纸），中央放 一短玻管，管内放 1/3-1/2 的推动剂，将插有滤纸的纸捻下端插入盛有推动剂的短玻管中， 迅速盖上相同直径的培养皿盖，放于弱光下或暗处，纸捻籍毛细管作用吸收溶剂，溶于溶剂 中的色素随之向四周扩散，不久在滤纸上得到各种色素的同心圆环：叶绿素 a 为蓝绿色，叶 绿素 b 为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。在滤纸上标出色素环的名称。 #问题与思考 （1）研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量碳酸钙有何作用？多加可能出现什么问题？ （2）实验中用纸层析法分离色素时，应注意哪些操作事项？ 3. 荧光现象 叶绿体色素分子吸收光量子后，分子内的电子跃迁而变为激发态，因激发能未被适当的 受体接受，被激发的电子又迅速回复到原来的能量水平，释放的能量除一部分转变为热能外， 常释放出比原来吸收光的波长更长的荧光或磷光，因此可观察到叶绿体色素提取液的反射光 为暗红色，这种现象称为荧光现象。 ) 取叶绿体色素提取液 4 毫升置于 10 毫升试管中（如果太浓可加少量 95％乙醇进行稀 释），在直射光下，分别对着光源、背着光源观察叶绿体色素提取液的颜色。 4. 叶绿素的皂化作用 叶绿素是一种双羧酸的酯类物质，能与碱发生皂化反应而生成叶绿酸的盐，形成盐后， 其亲水性大大加强，可溶于水中，用这一方法可将叶绿素和类胡萝卜素分开。 ) 取观察过荧光现象的 4 毫升叶绿体色素提取液，加入 1 毫升 20％KOH-甲醇溶液， 充分摇匀。静置片刻，再加入 5 毫升苯，混匀后，用滴管沿试管壁慢慢加入 1 毫升蒸馏水， 静置，可见溶液慢慢分为三层，上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素及叶黄素；下层是乙醇溶 液，其中溶有已皂化的叶绿素 a、b 及少量叶黄素。试管底部同时出现白色沉淀（这是细胞 蛋白质产生的乳化现象）。另取 4 毫升叶绿体色素提取液，直接加入 5 毫升苯和 1 毫升蒸馏 水，结果如何？ 5. 叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱 叶绿素和类胡萝卜素具有不同的光学特性，它们的吸收光谱可用分光镜检查或用分光光 度计精确测定，叶绿素吸收红光和兰紫光，类胡萝卜素吸收兰紫光
G调节分光镜，清晰地观察到光源的连续光谱后，将上述经皂化作用已分层的溶液分别对准通光孔，观察叶绿素和类胡萝卜素提取液的吸收光谱。将观察所得到结果用铅笔绘图表示。6.氢和铜对叶绿素中镁的代替作用叶绿素分子具有叶啉环，镁离子位于叭啉环的中央。叶绿素分子较不稳定，遇酸后，叶嘛环中央的镁易被氢取代，成为褐色去镁叶绿素，在有其它重金属离子存在时，氢又易被其它重金属元素取代，去镁叶绿素遇铜成为铜代叶绿素，铜代叶绿素稳定，在光下不易被破坏，所以用这一方法可制作绿色多汁植物的浸制标本。G取5毫升叶绿素提取液置于10毫升试管中，加入数滴5%的稀盐酸，慢慢摇动可见溶液逐渐由绿色变为褐色，叶绿素中的镁被盐酸中的氢取代，形成了去镁叶绿素。取一半去镁叶绿素溶液，加入少许醋酸铜结晶，缓慢加热，这时去镁叶绿素中的氢又被铜取代，铜代叶绿素为何种颜色？取一个200ml烧杯，倒入醋酸-醋酸铜溶液100ml，放入新鲜叶片数片，用酒精灯慢慢加热，随时观察叶片颜色的变化。问题与思考（1）解释叶绿体色素产生荧光现象的原因，透射光与反射光各呈何种颜色？为什么？（2）叶绿体色素遇碱后会发生何现象？解释原因。（3）叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱有何不同，绘图说明
) 调节分光镜，清晰地观察到光源的连续光谱后，将上述经皂化作用已分层的溶液分别 对准通光孔，观察叶绿素和类胡萝卜素提取液的吸收光谱。将观察所得到结果用铅笔绘图表 示。 6. 氢和铜对叶绿素中镁的代替作用 叶绿素分子具有卟啉环，镁离子位于卟啉环的中央。叶绿素分子较不稳定，遇酸后，卟 啉环中央的镁易被氢取代，成为褐色去镁叶绿素，在有其它重金属离子存在时，氢又易被其 它重金属元素取代，去镁叶绿素遇铜成为铜代叶绿素，铜代叶绿素稳定，在光下不易被破坏， 所以用这一方法可制作绿色多汁植物的浸制标本。 ) 取 5 毫升叶绿素提取液置于 10 毫升试管中，加入数滴 5%的稀盐酸，慢慢摇动可见溶 液逐渐由绿色变为褐色，叶绿素中的镁被盐酸中的氢取代，形成了去镁叶绿素。 取一半去镁叶绿素溶液，加入少许醋酸铜结晶，缓慢加热，这时去镁叶绿素中的氢又 被铜取代，铜代叶绿素为何种颜色？ 取一个 200ml 烧杯，倒入醋酸-醋酸铜溶液 100ml，放入新鲜叶片数片，用酒精灯慢慢 加热，随时观察叶片颜色的变化。 #问题与思考 （1）解释叶绿体色素产生荧光现象的原因，透射光与反射光各呈何种颜色？为什么？ （2）叶绿体色素遇碱后会发生何现象？解释原因。 （3）叶绿素与类胡萝卜素的吸收光谱有何不同，绘图说明
（4)将新鲜叶片放入醋酸一醋酸铜溶液中，加热过程中叶片颜色会发生哪些变化？为什么？若用蒸馏水煮会有何种现象？(黄淑莉）
（4）将新鲜叶片放入醋酸—醋酸铜溶液中，加热过程中叶片颜色会发生哪些变化？为什么？ 若用蒸馏水煮会有何种现象？ (黄淑莉)
实验报告专业：姓名：班级：组号：成绩：实验名称：1.叶绿体中主要含有哪些色素？依据色素的哪些性质进行提取与分离？纸层析分离后，各种色素环在滤纸上的位置如何？2.叶绿体色素有哪些物理化学性质和光学特性？这些性质有何生理意义？
实验报告 姓名： 专业： 班级： 组号: 成绩： 实验名称： 1.叶绿体中主要含有哪些色素？依据色素的哪些性质进行提取与分离？纸层析分离后，各 种色素环在滤纸上的位置如何？ 2.叶绿体色素有哪些物理化学性质和光学特性？这些性质有何生理意义？