第五章生物浸铀 微生物浸出是用浸矿微生物将矿石或精矿中有用组份转化为可溶化合物,并有选择性地 溶解出来,得到含金属的溶液,实现有用组份与杂质组份或脉石组份的分离过程,最终达到 回收有价金属的目的。利用微生物浸出铀矿石是生物技术在核工业领域中的一个突出的应用 例子。 1947年,柯尔默( Colmer)首先发现矿坑水中含一种将Fe2氧化为Fe的细菌,并证实 该菌在金属硫化矿的氧化和某些矿山坑道水酸化过程中起着重要作用口。1951年,坦波尔 ( Temple)和幸凯尔( Hinkle)从煤矿的酸性坑水中首先分离出一种能氧化金属硫化物的细 菌,并命名为氧化亚铁硫杆菌(或称氧化铁硫杆菌, Thiobacillus ferrooxidans)。美国肯 尼柯特( Kennecott)铜矿公司的尤它(Utah)矿,首先利用该菌渗透浸出硫化铜矿获得成 功,1958年取得这项技术的专利,这是第一个有关细菌浸出的专利2 细菌浸出铀矿石最早被葡萄牙的“镭公司”应用。他们从1953年开始进行铀矿石的自 然浸出研究,利用铀矿石中存在的或外加的黄铁矿(FeS2),在水和空气的作用下产生Fe 和SO2,使铀氧化为U02而溶解出来。在1956年的第二届国际和平利用原子能会议上,他 们发表了“铀的自然浸出法”的研究报告。从此,细菌浸出研究和应用开始受到各国的重视, 许多国家相继开展了从贫矿、废矿及表外矿中细菌浸出回收铀的研究工作。从20世纪60 年代起细菌浸出铀的技术用于工业生产。加拿大的安大略州伊利奥特湖( Dennison, Elliot Lake)曾是世界上规模最大的原地生物浸出铀矿的场所,该地区的斯坦洛克矿从1964年起 在采空区利用细菌浸出铀,平均每月回收U3026804kg,产量占当时全矿总产量的7%,且生产 成本由原来的每磅5美元降至3.3美元。其他产铀国如美国、法国、前苏联、澳大利亚等也 在不同程度上利用细菌浸出贫矿石的铀。我国在20世纪70年代初,也曾在湖南两矿即711 矿和水口山矿务局柏坊铜矿进行了细菌浸出铀的研究 2.1浸矿微生物的种类、特性 我们将可直接或间接参与金属硫化矿物的氧化和溶解过程称为微生物浸出,用于微生物 浸出的微生物菌种,称为浸矿微生物。在微生物湿法冶金过程中参与浸出的主要微生物类群 有以下几种: (1)中温细菌:硫杆菌属及钩端螺菌属 (2)中等嗜热细菌:硫化杆菌属 (3)极端嗜热细菌:嗜酸嗜热古生菌纲中的硫化叶菌属、酸菌属、生金球菌属及硫球菌属
1 第五章 生物浸铀 微生物浸出是用浸矿微生物将矿石或精矿中有用组份转化为可溶化合物，并有选择性地 溶解出来，得到含金属的溶液，实现有用组份与杂质组份或脉石组份的分离过程，最终达到 回收有价金属的目的。利用微生物浸出铀矿石是生物技术在核工业领域中的一个突出的应用 例子。 1947 年，柯尔默（Colmer）首先发现矿坑水中含一种将 Fe2+氧化为 Fe3+的细菌，并证实 该菌在金属硫化矿的氧化和某些矿山坑道水酸化过程中起着重要作用[1]。1951 年，坦波尔 （Temple）和幸凯尔（Hinkle）从煤矿的酸性坑水中首先分离出一种能氧化金属硫化物的细 菌，并命名为氧化亚铁硫杆菌（或称氧化铁硫杆菌，Thiobacillus ferrooxidans）。美国肯 尼柯特（Kennecott）铜矿公司的尤它（Utah）矿，首先利用该菌渗透浸出硫化铜矿获得成 功，1958 年取得这项技术的专利，这是第一个有关细菌浸出的专利[2]。 细菌浸出铀矿石最早被葡萄牙的“镭公司”应用。他们从 1953 年开始进行铀矿石的自 然浸出研究，利用铀矿石中存在的或外加的黄铁矿（FeS2），在水和空气的作用下产生 Fe3+ 和 SO4 2-，使铀氧化为 UO2 2+而溶解出来。在 1956 年的第二届国际和平利用原子能会议上，他 们发表了“铀的自然浸出法”的研究报告。从此，细菌浸出研究和应用开始受到各国的重视， 许多国家相继开展了从贫矿、废矿及表外矿中细菌浸出回收铀的研究工作。从 20 世纪 60 年代起细菌浸出铀的技术用于工业生产。加拿大的安大略州伊利奥特湖（Dennison,Elliot Lake）曾是世界上规模最大的原地生物浸出铀矿的场所，该地区的斯坦洛克矿从 1964 年起 在采空区利用细菌浸出铀，平均每月回收 U3O86804kg，产量占当时全矿总产量的 7%，且生产 成本由原来的每磅 5 美元降至 3.3 美元。其他产铀国如美国、法国、前苏联、澳大利亚等也 在不同程度上利用细菌浸出贫矿石的铀。我国在 20 世纪 70 年代初，也曾在湖南两矿即 711 矿和水口山矿务局柏坊铜矿进行了细菌浸出铀的研究[3]。 2.1 浸矿微生物的种类、特性 我们将可直接或间接参与金属硫化矿物的氧化和溶解过程称为微生物浸出，用于微生物 浸出的微生物菌种，称为浸矿微生物。在微生物湿法冶金过程中参与浸出的主要微生物类群 有以下几种： (1)中温细菌：硫杆菌属及钩端螺菌属 (2)中等嗜热细菌：硫化杆菌属 (3)极端嗜热细菌：嗜酸嗜热古生菌纲中的硫化叶菌属、酸菌属、生金球菌属及硫球菌属
2.1.1硫杆菌属( Thiobacillus) 小杆状细胞,以单根极生鞭毛运动,无休眠阶段,属革兰氏阴性菌种。能量获自一种或 多种还原态的或部分还原的含硫化合物,包括各种硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、连多硫酸 盐和亚硫酸盐。该菌属属无机化能营养类型,专性好氧。最适温度约28-30℃,p范围较宽 发现于海水、海泥、土壤、淡水、各种酸性矿水、污水、含硫矿泉中和硫沉积物内或附近, 所测定菌属的DNA的G+C含量范围是50~60克分子%的 硫杆菌属包括至少14个种,其中在生物浸铀中应用最广泛的是氧化亚铁硫杆菌、氧化 硫硫杆菌、排硫硫杆菌及蚀阴沟硫杆菌这四个种。 1氧化亚铁硫杆菌(T. ferrooxidans) 短杆菌,0.5微米×1.0微米,具有圆钝的末端,单生或对生,成短链者较少,显微镜 下的照片见图2-1。其能源为Feˉ和还原态硫,能将Fe'氧化成Fe3',硫代硫酸盐氧化成硫酸。 在pH值为1.5~3.5范围内生长良好,生长的最佳p值为2.0,在16~40℃存活,最佳生长 温度为30~35℃ 该菌在含亚铁的液体培养基中由于能将亚铁氧化成高铁,而使培养基由浅绿色变为红棕 色,最后由于Fe¨水解生成氢氧化物或铁矾而生成沉淀。在硫酸亚铁固体培养基上,借助显 微镜可以见到有微小菌落,直径约为1.0m,颜色由红变褐,并在菌落周围可见褐色沉淀。 在硫代硫酸盐固体培养基上形成圆形的微小菌落(直径0.5~1.0mm),有时会形成不规 则的边缘,菌落也会因为有硫磺的沉淀而呈白色。 图2-1氧化亚铁硫杆菌C-3菌株的细胞形态 A:菌体为赤藓红染色,25°投影,×1800 B:电镜观察照片,×10000
2 2.1.1 硫杆菌属（Thiobacillus） 小杆状细胞，以单根极生鞭毛运动，无休眠阶段，属革兰氏阴性菌种。能量获自一种或 多种还原态的或部分还原的含硫化合物，包括各种硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、连多硫酸 盐和亚硫酸盐。该菌属属无机化能营养类型，专性好氧。最适温度约 28~30℃，pH 范围较宽。 发现于海水、海泥、土壤、淡水、各种酸性矿水、污水、含硫矿泉中和硫沉积物内或附近， 所测定菌属的 DNA 的 G+C 含量范围是 50~60 克分子% [4]。 硫杆菌属包括至少 14 个种，其中在生物浸铀中应用最广泛的是氧化亚铁硫杆菌、氧化 硫硫杆菌、排硫硫杆菌及蚀阴沟硫杆菌这四个种。 1 氧化亚铁硫杆菌（T．ferrooxidans） 短杆菌，0.5 微米×1.0 微米，具有圆钝的末端，单生或对生，成短链者较少，显微镜 下的照片见图 2-1。其能源为 Fe2+和还原态硫，能将 Fe2+氧化成 Fe3+，硫代硫酸盐氧化成硫酸。 在 pH 值为 1.5~3.5 范围内生长良好，生长的最佳 pH 值为 2.0，在 16~40℃存活，最佳生长 温度为 30~35℃。 该菌在含亚铁的液体培养基中由于能将亚铁氧化成高铁，而使培养基由浅绿色变为红棕 色，最后由于 Fe3+水解生成氢氧化物或铁矾而生成沉淀。在硫酸亚铁固体培养基上，借助显 微镜可以见到有微小菌落，直径约为 1.0mm，颜色由红变褐，并在菌落周围可见褐色沉淀。 在硫代硫酸盐固体培养基上形成圆形的微小菌落（直径 0.5~1.0mm），有时会形成不规 则的边缘，菌落也会因为有硫磺的沉淀而呈白色。 A B 图 2-1 氧化亚铁硫杆菌 C-3 菌株的细胞形态 A：菌体为赤藓红染色，25º投影，×1800 B：电镜观察照片，×10000
2氧化硫硫杆菌(T. thiooxidans) 短杆菌,0.5微米×1.0~2.0微米,单生对生或成短链,显微镜下的照片见图2-2,其 能源为硫及其化合物。该菌在pH=1.4~6.0的范围内能生长,更低的范围可延至1.4以下 最适p值在2.5~5.8之间,最适温度为25~30℃。该菌的亚铁液体培养基保持清澈,由于 价铁的产生,迅速由琥珀色转为红褐色。如果pH上升至1.9以上,会产生高铁沉淀的水 合物,并形成一层由三价铁的水合物和细胞组成的膜。在硫代硫酸盐的固体培养基上生长的 微小菌落呈透明状或随着培养时间的延长而变成黄白色,菌落边缘整齐。 图2-2氧化硫硫杆菌在显微镜下的形态,×4500 3排碗硫杆菌(T. thioparus) 细短杆菌,0.5微米×1.0~3.0微米,平均0.5微米×1.7微米。靠氧化硫代硫酸盐成 硫酸盐获取能量。最适p值在6.6-7.2之间,在pH4.5~7.8之间生长,有一些菌株p达 到10也能生长,最适温度为28℃。在硫代硫酸盐洋菜(琼脂)上的菌落是小的(直径1~2毫 米),圆形,由于硫的沉淀而呈白黄色。 4蚀阴沟硫杆菌(T. concretivorus) 该菌与氧化硫硫杄菌类似,但它可以利用硝酸盐或氨离子作为氮源,不能利用亚硝酸 盐 2.1.2钩端螺菌属( Leptospirillum) 该菌属属于螺菌科( Spirillaceae),其中包括一个中度嗜热铁氧化钩端螺菌 (L. ferrooxidans)。铁氧化钩端螺菌(L. ferrooxidans)的最适生长温度为30℃左右,严 格好氧,专一性地通过氧化溶液中的Feˉ或矿物中的Feˉ来获取能量,在浸矿系统中通常和 氧化亚铁硫杆菌协调作用, 2.1.3硫化杆菌属( Sulfobaci1us) 它们的能量来源于Fe、硫磺及其它矿物,如硫铁矿、黄铜矿、砷黄铁矿、闪锌矿、亚
3 2 氧化硫硫杆菌（T．thiooxidans） 短杆菌，0.5 微米×1.0~2.0 微米，单生对生或成短链，显微镜下的照片见图 2-2，其 能源为硫及其化合物。该菌在 pH=1.4~6.0 的范围内能生长，更低的范围可延至 1.4 以下， 最适 pH 值在 2.5~5.8 之间，最适温度为 25~30℃。该菌的亚铁液体培养基保持清澈，由于 三价铁的产生，迅速由琥珀色转为红褐色。如果 pH 上升至 1.9 以上，会产生高铁沉淀的水 合物，并形成一层由三价铁的水合物和细胞组成的膜。在硫代硫酸盐的固体培养基上生长的 微小菌落呈透明状或随着培养时间的延长而变成黄白色，菌落边缘整齐。 图 2-2 氧化硫硫杆菌在显微镜下的形态，×4500 3 排硫硫杆菌（T．thioparus） 细短杆菌，0.5 微米×1.0~3.0 微米，平均 0.5 微米×1.7 微米。靠氧化硫代硫酸盐成 硫酸盐获取能量。最适 pH 值在 6.6~7.2 之间，在 pH4.5~7.8 之间生长，有一些菌株 pH 达 到 10 也能生长，最适温度为 28℃。在硫代硫酸盐洋菜(琼脂)上的菌落是小的（直径 1~2 毫 米），圆形，由于硫的沉淀而呈白黄色。 4 蚀阴沟硫杆菌（T．concretivorus） 该菌与氧化硫硫杆菌类似， 但它可以利用硝酸盐或氨离子作为氮源，不能利用亚硝酸 盐。 2.1.2 钩端螺菌属（Leptospirillum） 该菌属属于螺菌科（Spirillaceae），其中包括一个中度嗜热铁氧化钩端螺菌 （L.ferooxidans）。铁氧化钩端螺菌（L.ferrooxidans）的最适生长温度为 30℃左右，严 格好氧，专一性地通过氧化溶液中的 Fe2+或矿物中的 Fe2+来获取能量，在浸矿系统中通常和 氧化亚铁硫杆菌协调作用。 2.1.3 硫化杆菌属（Sulfobacillus） 它们的能量来源于 Fe2+、硫磺及其它矿物，如硫铁矿、黄铜矿、砷黄铁矿、闪锌矿、亚
锑硫酸盐、蓝铜矿、辉铜矿等。绝大多数霈要酵母提取液或某种有机物以及空气中C浓度 较高时才能旺盛生长。该菌属菌均严格好氧且极度嗜酸,广泛分布于自然界,主要集中在硫 化矿物床及火山地带。 2.1.4嗜酸嗜热古生菌纲( Thermoacidophili archaebacteria) 在该类群中,一共有四个属的菌种可以氧化硫化物作为浸矿菌,它们分别是硫化叶菌 属( Sulfolobus)、酸菌属( Eridanus)、生金球菌属( MetallospHaera)及硫球菌属 ( Sulfurococcus)。该四属菌均为兼性无机化能自养菌,可以在自养、兼性营养及异养条 件下生长。在自养条件下,细菌可以通过氧化元素硫、Fe2'或硫化物获取能量。在兼性营养 条件下,添加酵母膏或其他一些有机物可以促进它们的生长。它们均为好氧菌,极度嗜热嗜 酸,外形均为球形,细胞不具运动性,不具有鞭毛,主要分布在高温硫磺泉中。 这类细菌可潜在地用于顽固硫化矿物的快速、高温浸出,但易破碎的细胞壁(因缺少肽 聚糖)限制了它们在工业浸矿中的应用。同时,该类群菌是耐高温酶的重要来源,对它们 的研究和应用无疑将开拓酶工业的新邻域。 可见,浸矿细菌多为化能自养菌,嗜酸好氧,其最主要的特性是能氧化Fe2或S等还原 态物质为Fe及S02。人们也正是利用了它们这一生理特性进行细菌浸矿,常见的浸矿细菌 的主要特性见表2-1。 2.2浸矿微生物的培养基、采集、分离纯化、保藏 2.2.1浸矿徽生物的培养基 培养基指用人工方法配制的专供微生物生长繁殖的营养混合物。用于培养浸矿细菌的培 养基主要有表2-2所示的几种培养基
4 锑硫酸盐、蓝铜矿、辉铜矿等。绝大多数需要酵母提取液或某种有机物以及空气中 CO2 浓度 较高时才能旺盛生长。该菌属菌均严格好氧且极度嗜酸，广泛分布于自然界，主要集中在硫 化矿物床及火山地带。 2.1.4 嗜酸嗜热古生菌纲（Thermoacidophili archaebacteria） 在该类群中，一共有四个属的菌种可以氧化硫化物作为浸矿菌，它们分别是硫化叶菌 属（Sulfolobus）、酸菌属（Acidanus）、生金球菌属（MetallospHaera）及硫球菌属 （Sulfurococcus）。该四属菌均为兼性无机化能自养菌，可以在自养、兼性营养及异养条 件下生长。在自养条件下，细菌可以通过氧化元素硫、Fe2+或硫化物获取能量。在兼性营养 条件下，添加酵母膏或其他一些有机物可以促进它们的生长。它们均为好氧菌，极度嗜热嗜 酸，外形均为球形，细胞不具运动性，不具有鞭毛，主要分布在高温硫磺泉中。 这类细菌可潜在地用于顽固硫化矿物的快速、高温浸出，但易破碎的细胞壁（因缺少肽 聚糖）限制了它们在工业浸矿中的应用[5]。同时，该类群菌是耐高温酶的重要来源，对它们 的研究和应用无疑将开拓酶工业的新邻域[6]。 可见，浸矿细菌多为化能自养菌，嗜酸好氧，其最主要的特性是能氧化 Fe2+或 S 等还原 态物质为 Fe3+及 SO4 2-。人们也正是利用了它们这一生理特性进行细菌浸矿，常见的浸矿细菌 的主要特性见表 2-1。 2.2 浸矿微生物的培养基、采集、分离纯化、保藏 2.2.1 浸矿微生物的培养基 培养基指用人工方法配制的专供微生物生长繁殖的营养混合物。用于培养浸矿细菌的培 养基主要有表 2-2 所示的几种培养基
表2-1几种重要浸矿微生物的特性 菌名 氧化亚铁硫杆菌 氧化硫硫杆菌 嗜热硫氧化菌 蚀阴沟硫杆菌 氧化铁铁杆菌 氧化铁钩端螺旋 Thiobacillus Thiobacillus Sulfobacillus 特性 Thiobacillusconcretivo Ferrobacillus Leptospirillum 小微米) 0.5×1.0 06-1.0×10~1.6 0.2~04X0.9 极生鞭毛 单鞭毛 极生鞭毛 生长pH值 15~3.0(2.0)1.4-6.0(2.5~5.8) 1.2~5.0(1.924) 2.0-4.0 1.5-4.0(2.5-3.0) 生长温度℃ 6~40030~35 0-60(50-55) 25~30 碳源 S° 硫化物 硫氧化物 有机物 5l~56 注:表中“+”表示细菌能运动、需要或利用:表中“-”表示革兰氏染色为阴性或不能利用
5 表 2-1 几种重要浸矿微生物的特性 菌名 特性 氧化亚铁硫杆菌 Thiobacillus ferrooxidans 氧化硫硫杆菌 Thiobacillus thiooxidans 嗜热硫氧化菌 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 蚀阴沟硫杆菌 Thiobacillusconcretivo rus 氧化铁铁杆菌 Ferrobacillus ferrooxidans 氧化铁钩端螺旋 Leptospirillum ferrooxidans 大小(微米) 0.5×1.0 0.5×1.0 0.6~1.0×1.0~1.6 0.2~0.4×0.9 运 动 性 + + + + + 鞭 毛 极生鞭毛 单鞭毛 极生鞭毛 + 革兰氏染色 - - - - - - 生长 pH 值 1.5~3.0 (2.0) 1.4~6.0 (2.5~5.8) 1.2~5.0 (1.9~2.4) 2.0~4.0 3.5 1.5~4.0 (2.5~3.0) 生长温度℃ 16~40 (30~35) 25~30 20~60 (50~55) 28 15~20 25~30 需氧情况 + + + + + + 碳 源 + - + + + + 氨态氮 + + + + + + S 0 + + + + - - 硫化物 + - + - - + 硫氧化物 - + - + - Fe2+ + - + - + + 有机物 - - + - - - G+C[7] 55~65 51~53 46~49 51~56 注： 表中“+”表示细菌能运动、需要或利用；表中“-”表示革兰氏染色为阴性或不能利用
表2-2常见浸矿细菌的培养基 培养基名称 组成(g/L) 培养对象 (NH4)2SO40.15 KHPO4 0.05 铁氧化沟端螺菌 KCI 0.05 Ca(NO3)20.01 氧化铁铁杆菌 MgSO4·7H2O0.0 蒸馏水1000mL 氧化亚铁硫杆菌 FeSO47H2O10%(W/)溶液10mLpH20 (NH4)2SO43.0 KCI 0.1 MgSO4·7H2O0.5 KHPO4 0.5 氧化铁铁杆菌 Ca(NO3)0.01 蒸馏水700mL 氧化亚铁硫杆菌 eSO4·7H2O14.7%W/)溶液300mLpH2 FeSO4·7H2O0.01 NH4)2SO40.2 硫磺粉10 蒸馏水1000mL Waksman 氧化硫硫杆菌 MgSO4·7H200.5 CaCh2·2H2O025 pH20-3.5 硫磺粉10 KHPO, 4 MgSO4·7H200.3 氧化硫硫杆菌 FeSO4·7H2O0.01 CaCh2·2H2O0.25 蒸馏水1000mL pH20~3. (NH4)2SO40.2 Cach 0.2 KHPO4 3 Na2S2O3·5H2O Colmer 氧化亚铁硫杆菌 MgSO4·7H200.1 蒸馏水1000mL H1.5~2. 酵母浸出液1gL,及A溶液: NH4)2SO4 1. 3g ZnSO4 0.22mg K2HPO4 0.28g s 10g 硫化裂叶菌 叶硫球菌FeCl37H2O0.02g CoSO4 0.01mg Sulfolobus MnCl2·4H2O1.8mg NaB4O7·10HO4.5mg CuCh2·2H2O0.05mg MgSO4. 7H20 0.25g Na,MoO42H,O 0.03mg VoSO4·H2O003mg
6 表 2-2 常见浸矿细菌的培养基 培养基名称 组 成 (g/L) 培养对象 Leathen (NH4)2SO4 0.15 K2HPO4 0.05 铁氧化沟端螺菌 氧化铁铁杆菌 氧化亚铁硫杆菌 KCl 0.05 Ca(NO3)2 0.01 MgSO4•7H2O 0.05 蒸馏水 1000mL FeSO4•7H2O 10%(W/V) 溶液 10mL pH 2.0 9K (NH4)2SO4 3.0 KCl 0.1 氧化铁铁杆菌 氧化亚铁硫杆菌 MgSO4•7H2O 0.5 K2HPO4 0.5 Ca(NO3)2 0.01 蒸馏水 700mL FeSO4•7H2O 14.7%(W/V)溶液 300mL pH 2.0 Waksman FeSO4•7H2O 0.01 (NH4)2SO4 0.2 氧化硫硫杆菌 硫磺粉 10 蒸馏水 1000mL MgSO4•7H2O 0.5 CaCl2•2H2O 0.25 pH 2.0~3.5 ONM (NH4)2SO4 2 硫磺粉 10 氧化硫硫杆菌 K2HPO4 4 MgSO4•7H2O 0.3 FeSO4•7H2O 0.01 CaCl2•2H2O 0.25 蒸馏水 1000mL pH 2.0~3.5 Colmer (NH4)2SO4 0.2 CaCl2 0.2 氧化亚铁硫杆菌 K2HPO4 3 Na2S2O3•5H2O 5 MgSO4•7H2O 0.1 蒸馏水 1000mL pH 1.5~2. 酵母浸出液 1g/L，及 A 溶液: 硫化裂叶菌 （Sulfolobus） (NH4)2SO4 1.3g ZnSO4 0.22mg K2HPO4 0.28g S 10g 叶硫球菌 FeCl3•7H2O 0.02g CoSO4 0.01mg MnCl2•4H2O 1.8mg Na2B4O7•10H2O 4.5mg CuCl2•2H2O 0.05mg MgSO4•7H2O 0.25g Na2MoO4•2H2O 0.03mg VoSO4•H2O 0.03mg
CaCh·2H2O0.07g 蒸馏水1000mL pH2.0 (NH4)2SO40.5 KHPO: 0.2 Nacl 0 黄铁矿粉2% 嗜热硫氧化 Ca(NO3)·4H2O0.0 MgSO4·7H200.3 嗜热硫氧化菌 哮母浸出粉2g 蒸馏水1000mL pH2.5 培养基按外观物理状态可分 1液体培养基( Liquid medium) 在液体培养基中营养物质以溶质状态溶解于其中,使微生物能更充分地接触和利用养 料,因而也能更好地积累代谢产物。因此,在实验室中,液体培养基主要用于生理、代谢研 究及获得大量菌体:在生产中,则用于大规模生产、发酵 9K、 Heathen培养基由于有易被氧化的FeS04·7H20,一旦温度超过50℃,其中的Fe2 就会自发地快速氧化,并生成硫酸高铁、水合硫酸铁及黄钾铁钒沉淀。解决的办法有: (1)调节培养基的pH值至1.5。在配制上述两种培养基时,p值是一个很重要的考虑 因素。pH值高则培养基经高温灭菌后,会在瓶底生成沉淀,而使溶液浑浊:;实验表明,在 pH值低的溶液中,培养基的各成分溶解度大些。 (2)减少铁盐及磷酸盐的用量并补充少量的酵母膏。调整后的低磷酸盐培养基组成如 下(g/L):KlPO40.4、MgSO°7H200.4、(NH4)2S00.4、FeS0·7H027.8、酵母膏0.2(也 可用谷胱苷肽0.1或半胱氨酸0.1);pH=1.5 (3)将FeS04·TH0溶液单独过滤灭菌,再与用高温灭菌的培养基中的其他无机盐溶液 混合。这种方法得到的培养基Fe2被氧化成Fe的量少,培养基为浅绿色澄清溶液 2半固体培养基(Semi- solid medium) 在液体培养基中加入0.2~0.5%的琼脂作凝固剂,就可得到半固体培养基。半固体培养基 呈现出在容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后能破散的状态。半固体培养基在微生物实验 中有许多独特的用途,如细菌的动力观察(在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种,观察 细菌的运动能力),各种厌氧菌的培养及菌种保藏等。绝大多数的浸矿细菌是能运动的,可 以通过这种方法来鉴定菌种 3固体培养基( Solid medium)
7 CaCl2•2H2O 0.07g 蒸馏水 1000mL pH 2.0 嗜热硫氧化 菌 (NH4)2SO4 0.5 K2HPO40.2 嗜热硫氧化菌 NaCl 0.2 黄铁矿粉 2% Ca(NO3)2•4H2O 0.07 MgSO4•7H2O 0.3 酵母浸出粉 2g 蒸馏水 1000mL pH 2.5 培养基按外观物理状态可分： 1 液体培养基（Liquid medium） 在液体培养基中营养物质以溶质状态溶解于其中，使微生物能更充分地接触和利用养 料，因而也能更好地积累代谢产物。因此，在实验室中，液体培养基主要用于生理、代谢研 究及获得大量菌体；在生产中，则用于大规模生产、发酵。 9K、 Leathen 培养基由于有易被氧化的 FeSO4•7H2O，一旦温度超过 50℃，其中的 Fe2+ 就会自发地快速氧化，并生成硫酸高铁、水合硫酸铁及黄钾铁钒沉淀。解决的办法有： （1）调节培养基的 pH 值至 1.5。在配制上述两种培养基时，pH 值是一个很重要的考虑 因素。pH 值高则培养基经高温灭菌后，会在瓶底生成沉淀，而使溶液浑浊；实验表明，在 pH 值低的溶液中，培养基的各成分溶解度大些。 （2）减少铁盐及磷酸盐的用量并补充少量的酵母膏。调整后的低磷酸盐培养基组成如 下（g/L）：K2HPO4 0.4、 MgSO4•7H2O 0.4、(NH4)2SO4 0.4、FeSO4•7H2O 27.8、酵母膏 0.2（也 可用谷胱苷肽 0.1 或半胱氨酸 0.1）；pH=1.5。 （3）将 FeSO4•7H2O 溶液单独过滤灭菌，再与用高温灭菌的培养基中的其他无机盐溶液 混合。这种方法得到的培养基 Fe2+被氧化成 Fe3+的量少，培养基为浅绿色澄清溶液。 2 半固体培养基（Semi-solid medium） 在液体培养基中加入 0.2~0.5%的琼脂作凝固剂，就可得到半固体培养基。半固体培养基 呈现出在容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后能破散的状态。半固体培养基在微生物实验 中有许多独特的用途，如细菌的动力观察（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，观察 细菌的运动能力），各种厌氧菌的培养及菌种保藏等。绝大多数的浸矿细菌是能运动的，可 以通过这种方法来鉴定菌种。 3 固体培养基（Solid medium）
在液体培养基中加入1%2%琼脂或5%~12%明胶作凝固剂,就可制成遇热可融化、冷却 后则凝固的固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保藏、鉴定等。T.f菌种 在琼脂培养基上生长很弱,难以形成菌落,为菌种分离及遗传操作带来了很大困难。出现这 种情况的主要原因是琼脂在酸性条件下生成的水解产物对菌体有毒害作用。针对这个问题可 采用多种方法克服: (1)适当地降低琼脂浓度,小于2% (2)控制p值在3.0左右,pH值太低,琼脂粉因水解而不凝固:皿值太高,细菌的 生长缓慢 (3)适当降低FeS0·7HO和磷酸盐的浓度,分别不宜超过22.2g/L和0.05g/L (4)选用质量较好的琼脂,如琼脂糖等; (5)经过多年探索,彭基斌、颜望明等硏究设计出一种新的适用于氧化亚铁硫杄菌遗 传操作的固体培养基,称之为2:2培养基。组成为:FeS0·7H02‰、Na2S2O3·5H02‰、 (MH)2SO44.5‰、KC10.15‰、MgSO·7H200.75‰、琼脂粉6‰,pH4.6~4.8。这种培养基 含两种能源,亚铁和硫代硫酸钠,p在4.6~4.8范围内,至少卡那霉素(300μg/m)和链 霉素(200~300μg/m)可以在该培养基上使用。尽管氧化亚铁硫杆菌形成菌落需要两周时 间,但菌落形成率相对较高。在2:2培养基上生长,形态特征明显、稳定,氧化亚铁硫杆 菌、抗卡那霉素和抗链霉素的自发突变率均低于103,这就为利用这两种抗生素为遗传标记 选择转移接合子奠定了基础。 (6)除此之外还可采用ISP固体培养基。ISP固体培养基的配制田:溶液A,300mL 蒸馏水中加入FeSO3·TH20,配成浓度33.4%的溶液;用6MH2SO调p值至2.5,搅拌至几乎 无色,用细菌滤膜灭菌后,置于室温中。溶液B,550mL蒸馏水中加入(NH)2S06.0g、KCl0.2g、 MgSO1·TH201.0g、Ca(NO3)20.02g,调p值至3.0,121℃,1.2latm,灭菌15min。溶液C, 纯化的琼脂7.0g加到150m水中,浸泡15min,在1升锥形瓶中升温至121℃,1.21atm灭 菌5min。B和C从高压釜中取出,在空气中冷却5min,然后将B、C混合,将A加入上述 混合物,并搅匀。三者混合物倒于平板上,深度约为培养皿的高度的一半 2.2.2浸矿徽生物的采集、分离 从自然界中采集菌种及在实验室中培养所获得的菌种是矿物生物技术取得成就的第 步。对于研究与使用者而言,工作微生物可从菌种保藏机构直接购得。但多数情况,仍需从 自然界中采集。 浸矿微生物可能存在的地点有以下一些:
8 在液体培养基中加入 1%~2%琼脂或 5%~12%明胶作凝固剂，就可制成遇热可融化、冷却 后则凝固的固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保藏、鉴定等。T．f 菌种 在琼脂培养基上生长很弱，难以形成菌落，为菌种分离及遗传操作带来了很大困难。出现这 种情况的主要原因是琼脂在酸性条件下生成的水解产物对菌体有毒害作用。针对这个问题可 采用多种方法克服： （1）适当地降低琼脂浓度，小于 2%； （2）控制 pH 值在 3.0 左右，pH 值太低，琼脂粉因水解而不凝固；pH 值太高，细菌的 生长缓慢； （3）适当降低 FeSO4•7H2O 和磷酸盐的浓度，分别不宜超过 22.2g/L 和 0.05g/L[8，9] ； （4）选用质量较好的琼脂，如琼脂糖等； （5）经过多年探索，彭基斌、颜望明等研究设计出一种新的适用于氧化亚铁硫杆菌遗 传操作的固体培养基，称之为 2∶2 培养基[10]。组成为：FeSO4•7H2O 2‰、Na2S2O3•5H2O 2‰、 (NH4)2SO4 4.5‰、KCl 0.15‰、MgSO4•7H2O 0.75‰、琼脂粉 6‰，pH4.6~4.8。这种培养基 含两种能源，亚铁和硫代硫酸钠，pH 在 4.6~4.8 范围内，至少卡那霉素（300μg/mL）和链 霉素（200~300μg/mL）可以在该培养基上使用。尽管氧化亚铁硫杆菌形成菌落需要两周时 间，但菌落形成率相对较高。在 2∶2 培养基上生长，形态特征明显、稳定，氧化亚铁硫杆 菌、抗卡那霉素和抗链霉素的自发突变率均低于 10- 8，这就为利用这两种抗生素为遗传标记、 选择转移接合子奠定了基础。 （6）除此之外还可采用 ISP 固体培养基。ISP 固体培养基的配制[11]：溶液 A，300 mL 蒸馏水中加入 FeSO4•7H2O，配成浓度 33.4%的溶液；用 6MH2SO4 调 pH 值至 2.5，搅拌至几乎 无色，用细菌滤膜灭菌后，置于室温中。溶液 B，550mL 蒸馏水中加入(NH4)2SO4 6.0g、KCl 0.2g、 MgSO4·7H2O 1.0g、Ca(NO3)2 0.02g，调 pH 值至 3.0，121℃，1.21atm，灭菌 15min。溶液 C， 纯化的琼脂 7.0g 加到 150mL 水中，浸泡 15min，在 1 升锥形瓶中升温至 121℃，1.21atm 灭 菌 5min。B 和 C 从高压釜中取出，在空气中冷却 5 min，然后将 B、C 混合，将 A 加入上述 混合物，并搅匀。三者混合物倒于平板上，深度约为培养皿的高度的一半。 2.2.2 浸矿微生物的采集、分离 从自然界中采集菌种及在实验室中培养所获得的菌种是矿物生物技术取得成就的第一 步。对于研究与使用者而言，工作微生物可从菌种保藏机构直接购得。但多数情况，仍需从 自然界中采集。 浸矿微生物可能存在的地点有以下一些：
(1)矿山、矿堆或尾矿中流淌的酸性水 (2)矿石本身; (3)热泉水样或矿浆 在选择采集地点时,应结合将来的工作目的选择合适的地方,例如,研究细菌浸出铀 矿的影响因素,则最好到铀矿山采集菌种。 现以浸矿细菌中最常见的氧化亚铁硫杆菌为例,介绍浸矿微生物的采集、分离的基本 方法 氧化亚铁硫杆菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性(pH<4)矿坑水中,因此可到这 些矿山采集,采集的步骤如下 取50~25omL细口瓶,洗净并配好胶塞,用牛皮纸包扎好瓶口,置于120℃烘箱灭菌 20min,待冷却后即可作为细菌取样瓶。带取样瓶到矿山取酸性矿坑水。如矿坑水的pH为 1.5~3.5并呈红棕色(说明有Fe存在),则很可能存在氧化亚铁硫杆菌,可对此水样进行分 离培养。取样时将牛皮纸取下,用一只手拔去瓶塞,另一只手持瓶接取或舀取水样,其量不 宜超过瓶容量的2/3。(若所取样不是水样而是已被氧化成棕褐色的潮湿矿块,则应在灭菌 的取样瓶中,加入约占瓶容积1/3的液体培养基)取样后,立即盖好胶塞,并用牛皮纸包好, 在瓶上贴上标签,标明取样地点及时间 为了便于将来可用矿物培养基培养和保存细菌,可随便采取采样矿山的矿样少许,这 样的矿样为该菌所适应,十分适合于该菌的培养 为了分离、培养所需细菌,还需配制好专供这种菌生长的 Leather或K培养基,配好 的培养基用蒸气灭菌15min,然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的100毫升的 角瓶中。塞好棉塞置于20~30℃的恒温条件下静置培养(或振荡培养)7~10天。由于细菌 生长繁殖,三角瓶中培养基的颜色由浅绿色变为红棕色,最后在瓶底出现高铁沉淀(与空白 对照)。选择变化最快,颜色最深的三角瓶,在瓶中取1毫升培养液,接种到装有新培养基 的三角瓶中,同样培养。培养液比头一次更快地变成红棕色,以后按同样方法反复转移培养, 至少十次以上。每转移一次,接种量逐渐减少,只需1~2滴就可。而所培养的细菌却越来越 活跃,只需培养3-5天就可把培养基中的Fe氧化成Fe。在转移培养中,借助培养基的高 酸度及高浓度亚铁和高铁离子,可杀死和淘汰一些杂菌,氧化亚铁硫杆菌可得到充分繁殖, 活性越来越好。 可用如下方法对培养的氧化亚铁硫杆菌进行初步检査和鉴定 (1)肉眼观察
9 （1）矿山、矿堆或尾矿中流淌的酸性水； （2）矿石本身； （3）热泉水样或矿浆。 在选择采集地点时，应结合将来的工作目的选择合适的地方，例如，研究细菌浸出铀 矿的影响因素，则最好到铀矿山采集菌种。 现以浸矿细菌中最常见的氧化亚铁硫杆菌为例，介绍浸矿微生物的采集、分离的基本 方法。 氧化亚铁硫杆菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性(pH<4)矿坑水中，因此可到这 些矿山采集，采集的步骤如下： 取 50~250mL 细口瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于 120℃烘箱灭菌 20min，待冷却后即可作为细菌取样瓶。带取样瓶到矿山取酸性矿坑水。如矿坑水的 pH 为 1.5~3.5 并呈红棕色（说明有 Fe3+存在），则很可能存在氧化亚铁硫杆菌，可对此水样进行分 离培养。取样时将牛皮纸取下，用一只手拔去瓶塞，另一只手持瓶接取或舀取水样，其量不 宜超过瓶容量的 2/3。（若所取样不是水样而是已被氧化成棕褐色的潮湿矿块，则应在灭菌 的取样瓶中，加入约占瓶容积 1/3 的液体培养基）取样后，立即盖好胶塞，并用牛皮纸包好， 在瓶上贴上标签，标明取样地点及时间。 为了便于将来可用矿物培养基培养和保存细菌，可随便采取采样矿山的矿样少许，这 样的矿样为该菌所适应，十分适合于该菌的培养。 为了分离、培养所需细菌，还需配制好专供这种菌生长的 Leathen 或 9K 培养基，配好 的培养基用蒸气灭菌 15min，然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的 100 毫升的三 角瓶中。塞好棉塞置于 20~30℃的恒温条件下静置培养（或振荡培养）7~10 天。由于细菌 生长繁殖，三角瓶中培养基的颜色由浅绿色变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀（与空白 对照）。选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取 1 毫升培养液，接种到装有新培养基 的三角瓶中，同样培养。培养液比头一次更快地变成红棕色，以后按同样方法反复转移培养， 至少十次以上。每转移一次，接种量逐渐减少，只需 1~2 滴就可。而所培养的细菌却越来越 活跃，只需培养 3~5 天就可把培养基中的 Fe 2+氧化成 Fe 3+。在转移培养中，借助培养基的高 酸度及高浓度亚铁和高铁离子，可杀死和淘汰一些杂菌，氧化亚铁硫杆菌可得到充分繁殖， 活性越来越好。 可用如下方法对培养的氧化亚铁硫杆菌进行初步检查和鉴定： （1）肉眼观察
如有该菌生长,则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁,培养基的颜色由浅绿色变成红棕 色,最后产生高铁沉淀。(需作空白对照,因为空气也能将亚铁氧化成Fe",培养基的颜色 会由浅绿色变成黄色,并会产生沉淀附于瓶底。) (2)重铬酸钾容量法测定 用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁氧化成高铁的氧化率。用KCr2O-HgCl2法或 KCr02-SnCl2的方法测定培养基中的全铁量,再用KcrO或KnO滴定Fe2(酸性环境) 以此计算得Fe"的氧化率,氧化率高的,说明细菌生长旺盛。 (3)显微镜观察 用简单染色或革兰氏染色法对所培养的细菌进行染色,在显微镜下观察是否有T.f存 在。 2.2.3浸矿微生物的纯化 用上述方法获得的菌种往往不纯,其中会有杂菌。要想得到纯菌种,则需要作平板分离 浸矿细菌的分离纯化一般采用稀释涂布平板法、平板划线分离法和终点稀释法。 1稀释涂布平板法 稀释涂布平板法是一种有效而常用的微生物纯种分离方法。它是将一定浓度、一定量的 待分离菌液移到已凝固的培养基平板上,再用涂布棒迅速地将其均匀涂布,使长出单菌落而 达到分离的目的,见图2-3 各9mPH=25硫酸溶液 原菌液 涂布平板 ℃培养 挑单菌落 单菌落培养 图2-3稀释涂布平板分离示意图
10 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿色变成红棕 色，最后产生高铁沉淀。（需作空白对照，因为空气也能将亚铁氧化成 Fe3+，培养基的颜色 会由浅绿色变成黄色，并会产生沉淀附于瓶底。） （2）重铬酸钾容量法测定 用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁氧化成高铁的氧化率。用 K2Cr2O7-HgCl2 法或 K2Cr2O7-SnCl2 的方法测定培养基中的全铁量，再用 K2Cr2O7或 KMnO4 滴定 Fe2+（酸性环境）[12]， 以此计算得 Fe2+的氧化率，氧化率高的，说明细菌生长旺盛。 （3）显微镜观察 用简单染色或革兰氏染色法对所培养的细菌进行染色，在显微镜下观察是否有 T．f 存 在。 2.2.3 浸矿微生物的纯化 用上述方法获得的菌种往往不纯，其中会有杂菌。要想得到纯菌种，则需要作平板分离。 浸矿细菌的分离纯化一般采用稀释涂布平板法、平板划线分离法和终点稀释法。 1 稀释涂布平板法[13] 稀释涂布平板法是一种有效而常用的微生物纯种分离方法。它是将一定浓度、一定量的 待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒迅速地将其均匀涂布，使长出单菌落而 达到分离的目的，见图 2-3。 原菌液 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 单菌落培养 各9 硫酸溶液 涂布平板 30℃培养 挑单菌落 10-6 图 2-3 稀释涂布平板分离示意图