液态活检

液态活检 肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，靶向治疗和免疫治疗显著提高了晚期肺癌患者 的无进展生存期和总生存期。靶向治疗的前提是明确患者的分子分型，常规的分子检测以肿 瘤组织为"金标准"[1]，采用原发灶或单一转移灶的肿瘤组织获取DNA或RNA来检测基因突 变。然而，肿瘤在各种内源性和外源性选择压力的作用下不断进化，肿瘤基因组分子图谱也 在动态变化，特别是经靶向药物治疗后，细胞亚克隆增加，异质性增强[21。此外，获取肿瘤 组织为有创操作，无法多时间点重复采样，且肿瘤组织存在时间和空间异质性，活检或穿刺 样本不能代表肿瘤病灶的全貌。因此，以外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)为代表的"液态活检"受到了越来越多的关注。 液态活检是基于体液（如血液、尿液、唾液等）样本的一类非侵入性的检测方法，能够快捷、 无创地进行疾病诊断或治疗监测。其概念最早由Sorrells[3]于1974年提出，研究采用关节 腔内的滑液诊断滑膜炎。目前，液态活检技术已被用于肿瘤诊断、指导靶向用药、监测疗效 和耐药等方面。本文将从液态活检的样本类型、检测方法、临床应用等方面加以论述。 1液态活检的样本类型及其生物学特征 1.1以外周血为基础的液态活检样本 肿瘤细胞在体内不断更新、坏死、脱落，将DNA、RNA、蛋白质等细胞成分乃至肿瘤细胞 释放至血液循环。因此，肿瘤患者的外周血中可含有ctDNA、循环肿瘤RNA(circulating tumor RNA,ctRNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,.CTC)等，更关键的是这些介质携带 肿瘤基因组信息，能够反映肿瘤负荷及进展等情况。 (1)ctDNA:是指存在于外周血中且来源于肿瘤细胞的游离DNA。循环游离DNA (circulating free DNA,cfDNA)即非细胞结合的DNA,Mandel等[4]于1948年首次发现在 癌症患者的血液中存在非细胞结合核酸，即cfDNA。1977年，Leon等[5]发现肿瘤患者外周 血cfDNA的含量明显高于非肿瘤患者，这一重大发现促进了后续一系列研究.Stroun等[6] 首先发现肿瘤患者的cDNA携带肿瘤相关的基因变异，并相继被其他研究团队证实， cDNA包含了癌基因/抑癌基因的突变、微卫星不稳定、后生遗传学变异等基因变异信息 7-9]。因此，肿瘤患者外周血cfDNA一部分来自于肿瘤细胞，称之为ctDNA。 cDNA进入体液循环的机制尚不清楚，一般认为可通过细胞凋亡、坏死或主动分泌等方式 将cfDNA释放至血液循环或其他体液系统[10-15]。通过测序发现cfDNA片段大小集中 在166bp左右，为环绕核小体(147bp)及组蛋白H1接头DNA的长度之和[16,17刀。 而相对于非突变的cfDNA而言，ctDNA的长度短于cfDNA[18-21],通过大鼠移植瘤模型 分析发现ctDNA的长度为134~144bp[20],这种缩短的机制仍不清楚。而长度大于 1000bp的cfDNA更可能来自于正常细胞，通过外泌体释放至血液循环，或者来自坏死肿 瘤细胞所释放的DNA片段。研究发现cfDNA的半衰期为16分钟至2.5小时[22-25]。 因此，ctDNA的定量分析能够实时反映肿瘤的负荷大小。但受到半衰期短以及背景复杂的 影响，使得ctDNA在外周血中的占比波动较大，在临床实践中需要灵敏度高的方法才能满 足ctDNA的检测需求

液态活检 肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，靶向治疗和免疫治疗显著提高了晚期肺癌患者 的无进展生存期和总生存期。靶向治疗的前提是明确患者的分子分型，常规的分子检测以肿 瘤组织为"金标准"[1]，采用原发灶或单一转移灶的肿瘤组织获取 DNA 或 RNA 来检测基因突 变。然而，肿瘤在各种内源性和外源性选择压力的作用下不断进化，肿瘤基因组分子图谱也 在动态变化，特别是经靶向药物治疗后，细胞亚克隆增加，异质性增强[2]。此外，获取肿瘤 组织为有创操作，无法多时间点重复采样，且肿瘤组织存在时间和空间异质性，活检或穿刺 样本不能代表肿瘤病灶的全貌。因此，以外周血循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）为代表的"液态活检"受到了越来越多的关注。 液态活检是基于体液（如血液、尿液、唾液等）样本的一类非侵入性的检测方法，能够快捷、 无创地进行疾病诊断或治疗监测。其概念最早由 Sorrells[3]于 1974 年提出，研究采用关节 腔内的滑液诊断滑膜炎。目前，液态活检技术已被用于肿瘤诊断、指导靶向用药、监测疗效 和耐药等方面。本文将从液态活检的样本类型、检测方法、临床应用等方面加以论述。 1 液态活检的样本类型及其生物学特征 1.1 以外周血为基础的液态活检样本 肿瘤细胞在体内不断更新、坏死、脱落，将 DNA、RNA、蛋白质等细胞成分乃至肿瘤细胞 释放至血液循环。因此，肿瘤患者的外周血中可含有 ctDNA、循环肿瘤 RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）等，更关键的是这些介质携带 肿瘤基因组信息，能够反映肿瘤负荷及进展等情况。 （1）ctDNA ：是指存在于外周血中且来源于肿瘤细胞的游离 DNA。循环游离 DNA （circulating free DNA，cfDNA）即非细胞结合的 DNA，Mandel 等[4]于 1948 年首次发现在 癌症患者的血液中存在非细胞结合核酸，即 cfDNA。1977 年，Leon 等[5]发现肿瘤患者外周 血 cfDNA 的含量明显高于非肿瘤患者，这一重大发现促进了后续一系列研究。Stroun 等 [6] 首先发现肿瘤患者的 cfDNA 携带肿瘤相关的基因变异，并相继被其他研究团队证实， cfDNA 包含了癌基因 / 抑癌基因的突变、微卫星不稳定、后生遗传学变异等基因变异信息 [7-9]。因此，肿瘤患者外周血 cfDNA 一部分来自于肿瘤细胞，称之为 ctDNA。 cfDNA 进入体液循环的机制尚不清楚，一般认为可通过细胞凋亡、坏死或主动分泌等方式 将 cfDNA 释放至血液循环或其他体液系统 [10-15]。通过测序发现 cfDNA 片段大小集中 在 166 bp 左右，为环绕核小体（147 bp）及组蛋白 H1 接头 DNA 的长度之和 [16,17]。 而相对于非突变的 cfDNA 而言，ctDNA 的长度短于 cfDNA[18-21]，通过大鼠移植瘤模型 分析发现 ctDNA 的长度为 134 ～ 144 bp[20]，这种缩短的机制仍不清楚。而长度大于 1000 bp 的 cfDNA 更可能来自于正常细胞，通过外泌体释放至血液循环，或者来自坏死肿 瘤细胞所释放的 DNA 片段。研究发现 cfDNA 的半衰期为 16 分钟至 2.5 小时 [22-25]。 因此，ctDNA 的定量分析能够实时反映肿瘤的负荷大小。但受到半衰期短以及背景复杂的 影响，使得 ctDNA 在外周血中的占比波动较大，在临床实践中需要灵敏度高的方法才能满 足 ctDNA 的检测需求

(2)CTC:是指肿瘤在生长过程中释放至血液循环的肿瘤细胞。一般认为CTC进入血液 循环的机制，一方面是通过对血管的内渗作用，发生上皮向间质细胞的转化；另一方面是肿 瘤相关的脉管系统软化导致肿瘤细胞被动脱落至血液循环[26)]。1869年，澳大利亚内科医 生Thomas Ashworth[27刀首次报道了CTC的存在，CTCs与肿瘤组织有相同的生物学信息， 具备完整的基因组、转录组及蛋白质组信息。从肿瘤患者外周血中可分离出单个或成团的 CTCs,且CTCs的数量与预后及生存相关[28]。外周血中CTC含量极低，1ml血液中大 约含有10个CTCs,同时含有数百万个白细胞和10亿个红细胞，因此背景较为复杂[26]。 (3)外泌体：Pan等[29和Johnstone等[30]首次定义了外泌体，其通过内吞途径产 生，通过多泡体(multivesicular body,MVBs)从细胞膜释放至细胞外环境中[31,32]，四分 子交联体家族成员CD9、CD63、CD81及CD82是识别外泌体的特异性生物标志物[32,33]。 外泌体直径为40~100nm,密度为1.13~1.19g/ml[34。在生理或病理条件下，多种 细胞均可分泌外泌体，包括免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等[35-37刀。由于外泌体携带亲代 细胞的生物学和遗传学信息，如RNAs、微小RNAs(microRNAS,niRNAS)、DNA、蛋白 质等，因此能够反映亲代细胞的生物学特性。同时，由于外泌体是脂质双分子层结构，其携 带的生物学和遗传学信息不易被降解。外泌体的主要功能是进行细胞间物质和信息的交换， 其具体功能取决于亲代细胞的类型及其所携带的信息成分，如肿瘤细胞来源的外泌体主要参 与肿瘤进展、耐药信息传递等，正常细胞来源的外泌体主要发挥维持细胞稳态的作用[38]。 (4)ctRNA:1996年，在黑色素瘤患者的血液中首次检出循环肿瘤相关信使RNA (messenger RNA,mRNA)[39]。此后，相继在实体瘤的外周血中发现其他类型的RNA, 如miRNAs、.IncRNAs[4O]。受多种原因影响，肿瘤相关mRNA的存在具有临床相关性，包 括肿瘤特异性基因表达谱的鉴定。DNA的体细胞突变仅代表癌症相关分子变异的一个子集， 未完全概括可能由表观遗传改变、miRNA的作用或其他机制引起的基因表达谱的变化。因 此，基于血液的癌症RNA分析或可提供更有价值的信息。 miRNA是外周血中含量最丰富的一类RNA,血液中的外泌体、凋亡小体、蛋白-miRNA复 合物及肿瘤驯化的血小板(tumor-educated platelets,TEP)均可携带miRNA[40-42]。对血 液中mRNA和miRNA的分析仍处于探索阶段，临床应用价值也在研究中。 1.2其他体液的液态活检样本 (1)尿液：尿液上清含有DNA片段，1999年Zhang等[43]首次于尿液上清中检出Y- 染色体SRY基因片段，I0年后证实尿液中的cfDNA即transrenal DNA(tr-DNA),是肾 脏清除血液中cfDNA的结果（图1）[44,45]。理论上，尿液是一种有效的肿瘤DNA的来 源，收集简便，无任何侵袭性。 (2)脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF):CSF由脑室的脉络膜丛分泌，如果CSF与中枢神 经系统的所有细胞直接接触（包括肿瘤细胞），理论上CSF也是ctDNA的有效来源之一。 对于肺癌患者而言，通过CSF-ctDNA检测可以分析脑转移病灶的基因变异特征。定位于中 枢神经系统的肿瘤病灶，CSF中ctDNA含量明显大于血浆中的含量，并可以通过检测CSF- ctDNA体细胞突变信息监测脑部病灶的变化[46]

（2）CTC ：是指肿瘤在生长过程中释放至血液循环的肿瘤细胞。一般认为 CTC 进入血液 循环的机制，一方面是通过对血管的内渗作用，发生上皮向间质细胞的转化；另一方面是肿 瘤相关的脉管系统软化导致肿瘤细胞被动脱落至血液循环 [26]。1869 年，澳大利亚内科医 生 Thomas Ashworth[27]首次报道了 CTC 的存在，CTCs 与肿瘤组织有相同的生物学信息， 具备完整的基因组、转录组及蛋白质组信息。从肿瘤患者外周血中可分离出单个或成团的 CTCs，且 CTCs 的数量与预后及生存相关 [28]。外周血中 CTC 含量极低，1 ml 血液中大 约含有 10个 CTCs，同时含有数百万个白细胞和 10 亿个红细胞，因此背景较为复杂 [26]。 （3）外泌体：Pan 等 [29] 和 Johnstone 等 [30] 首次定义了外泌体，其通过内吞途径产 生，通过多泡体（multivesicular body，MVBs）从细胞膜释放至细胞外环境中 [31,32]，四分 子交联体家族成员 CD9、CD63、CD81 及 CD82 是识别外泌体的特异性生物标志物 [32,33]。 外泌体直径为 40 ～ 100 nm，密度为 1.13 ～ 1.19 g/ml[34]。在生理或病理条件下，多种 细胞均可分泌外泌体，包括免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等 [35-37]。由于外泌体携带亲代 细胞的生物学和遗传学信息，如 RNAs、微小 RNAs（microRNAs，miRNAs）、DNA、蛋白 质等，因此能够反映亲代细胞的生物学特性。同时，由于外泌体是脂质双分子层结构，其携 带的生物学和遗传学信息不易被降解。外泌体的主要功能是进行细胞间物质和信息的交换， 其具体功能取决于亲代细胞的类型及其所携带的信息成分，如肿瘤细胞来源的外泌体主要参 与肿瘤进展、耐药信息传递等，正常细胞来源的外泌体主要发挥维持细胞稳态的作用 [38]。 （4）ctRNA ：1996 年，在黑色素瘤患者的血液中首次检出循环肿瘤相关信使 RNA （messenger RNA，mRNA）[39]。此后，相继在实体瘤的外周血中发现其他类型的 RNA， 如 miRNAs、lncRNAs[40]。受多种原因影响，肿瘤相关 mRNA 的存在具有临床相关性，包 括肿瘤特异性基因表达谱的鉴定。DNA 的体细胞突变仅代表癌症相关分子变异的一个子集， 未完全概括可能由表观遗传改变、miRNA 的作用或其他机制引起的基因表达谱的变化。因 此，基于血液的癌症 RNA 分析或可提供更有价值的信息。 miRNA 是外周血中含量最丰富的一类 RNA，血液中的外泌体、凋亡小体、蛋白 -miRNA 复 合物及肿瘤驯化的血小板（tumor-educated platelets，TEP）均可携带 miRNA[40-42]。对血 液中 mRNA 和 miRNA 的分析仍处于探索阶段，临床应用价值也在研究中。 1.2 其他体液的液态活检样本 （1）尿液：尿液上清含有 DNA 片段，1999 年 Zhang 等 [43] 首次于尿液上清中检出 Y- 染色体 SRY 基因片段，10 年后证实尿液中的 cfDNA 即 transrenal DNA（tr-DNA），是肾 脏清除血液中 cfDNA 的结果（图 1）[44,45]。理论上，尿液是一种有效的肿瘤 DNA 的来 源，收集简便，无任何侵袭性。 （2）脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）：CSF 由脑室的脉络膜丛分泌，如果 CSF 与中枢神 经系统的所有细胞直接接触（包括肿瘤细胞），理论上 CSF 也是 ctDNA 的有效来源之一。 对于肺癌患者而言，通过 CSF-ctDNA 检测可以分析脑转移病灶的基因变异特征。定位于中 枢神经系统的肿瘤病灶，CSF 中 ctDNA 含量明显大于血浆中的含量，并可以通过检测 CSF￾ctDNA 体细胞突变信息监测脑部病灶的变化 [46]

2液态活检的相关技术 2.1液态活检的捕获技术 (I)分离游离核酸：从血液中分离ctDNA与RNA的常用方法是通过商品化试剂盒来提 取，提取ctDNA应用较为成熟的试剂盒为Qiagen公司的产品，提取RNA常用试剂盒为 SPLIT RNA Extr action Kit[47] (2)富集和捕获CTC:CTC的富集主要基于CTC的物理学（大小、密度、电极、可变形 性等)和生物学（细胞表面蛋白、生存能力及侵袭性）特征，基于物理学特征的富集方法包 括滤膜法、密度梯度离心法或二维电泳法；基于生物学特征的方法主要是免疫磁珠法，即通 过CTC表面的上皮细胞抗原EpCAM进行正向富集，或者基于白细胞表面的CD45抗原 进行负向富集[48,49]。目前CTC富集捕获技术见表1。 (3)分离外泌体：分离外泌体常用的方法是密度梯度超速离心法，或根据外泌体表面特异 性标志物CD9、CD63、CD81等进行富集[50,51]。 2.2液态活检的检测技术 液态活检常用的检测技术包括以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为基础的 检测技术，如突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)、 Cobas-PCR、数字PCR(digital PCR,dPCR)及二代测序(next generation sequencing,NGS) 技术等。检测技术的发展进一步推动了液态活检在临床上的应用，本文将简要介绍国内常用 的检测技术。 (1)ARMS-PCR:Newton等[52]最早建立了ARMS-PCR方法检测已知的突变位点。其 原理是根据特异的突变位点设计引物，仅目的片段存在突变才可进行PC扩增，产生荧光 信号，同时阻滞野生型基因的PCR扩增反应。与其他基于PCR的检测技术相比，ARMS- PCR在检测单个已知突变位点时灵敏度更高(1%)，更便捷。ARMS-PCR的升级技术super ARMS-PCR,其灵敏度进一步提升，可达O.2%,更适用于血液表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,.EGFR)突变的检测[53,54。目前，ARMS-PCR和super ARMS-PCR 均已获得国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration,CFDA)批准用 于晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)检测EGFR突变，指导临床靶向 用药。 (2)Cobas-PCR:是另一种基于等位基因特异性扩增的实时荧光PCR,其对引物做了进一 步修饰，导致引物与野生型片段结合时极不稳定，从而降低假阳性率，其第二代技术C0bs V2.0可同时检测组织和血液样本，并增加EGFR突变检测位点至42个[55]。 (3)dPCR:用于血液EGFR突变检测的数字PCR技术主要包括微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和QuantStudio3 dPCR,灵敏度约为O.Ol%。ddPCR基于乳液微滴

2 液态活检的相关技术 2.1 液态活检的捕获技术 （1）分离游离核酸：从血液中分离 ctDNA 与 RNA 的常用方法是通过商品化试剂盒来提 取，提取 ctDNA 应用较为成熟的试剂盒为 Qiagen 公司的产品，提取 RNA 常用试剂盒为 SPLIT RNA Extr action Kit[47]。 （2）富集和捕获 CTC ：CTC 的富集主要基于 CTC 的物理学（大小、密度、电极、可变形 性等）和生物学（细胞表面蛋白、生存能力及侵袭性）特征，基于物理学特征的富集方法包 括滤膜法、密度梯度离心法或二维电泳法；基于生物学特征的方法主要是免疫磁珠法，即通 过 CTC 表面的上皮细胞抗原 EpCAM 进行正向富集，或者基于白细胞表面的 CD45 抗原 进行负向富集 [48,49]。目前 CTC 富集捕获技术见表 1。 （3）分离外泌体：分离外泌体常用的方法是密度梯度超速离心法，或根据外泌体表面特异 性标志物 CD9、CD63、CD81 等进行富集 [50,51]。 2.2 液态活检的检测技术 液态活检常用的检测技术包括以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的 检测技术，如突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）、 Cobas-PCR、数字 PCR（digital PCR，dPCR）及二代测序（next generation sequencing，NGS） 技术等。检测技术的发展进一步推动了液态活检在临床上的应用，本文将简要介绍国内常用 的检测技术。 （1）ARMS-PCR ：Newton 等 [52] 最早建立了 ARMS-PCR 方法检测已知的突变位点。其 原理是根据特异的突变位点设计引物，仅目的片段存在突变才可进行 PCR 扩增，产生荧光 信号，同时阻滞野生型基因的 PCR 扩增反应。与其他基于 PCR 的检测技术相比，ARMS￾PCR 在检测单个已知突变位点时灵敏度更高（1%），更便捷。ARMS-PCR 的升级技术 super ARMS-PCR，其灵敏度进一步提升，可达 0.2%，更适用于血液表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的检测 [53,54]。目前，ARMS-PCR 和 super ARMS-PCR 均已获得国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）批准用 于晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）检测 EGFR 突变，指导临床靶向 用药。 （2）Cobas-PCR ：是另一种基于等位基因特异性扩增的实时荧光 PCR，其对引物做了进一 步修饰，导致引物与野生型片段结合时极不稳定，从而降低假阳性率，其第二代技术 Cobas V2.0 可同时检测组织和血液样本，并增加 EGFR 突变检测位点至 42 个 [55]。 （3）dPCR ：用于血液 EGFR 突变检测的数字 PCR 技术主要包括微滴数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和 QuantStudio 3D dPCR，灵敏度约为 0.01%。ddPCR 基于乳液微滴

技术，将PC所需的反应体系分馏为2万个微滴，每个含有靶片段的微滴将发生扩增反 应，通过阳性微滴数进行靶基因突变拷贝数的定量分析[56)]。QuantStudio3 D dPCR以封闭 的芯片为基础，相较于其他dPCR平台，其成本低廉[57刀。目前，dPCR技术仅作为单基因 突变检测的一项重要补充，需在临床试验中进一步验证技术准确性与稳定性，以便在临床上 普及推广。 (4)NGS:即高通量测序技术，其原理是将待测DNA分子打断成若干个小片段，并于两 端加上接头，单个片段进行扩增，复制碱基的同时检测信号。根据检测的基因数量和类型可 以分为靶向panel测序、全外显子测序(whole exome sequencing,WES)、全基因组测序 (whole genome sequencing,.WGS)及转录组测序等。NGS的流程一般为：样本制备、建 库、靶向富集、高通量测序以及生物信息学分析[58]。NGS可对数以百万计的DNA分子 同时进行测序，允许检测多个已知或未知的基因变异，具有对样本含量要求低、灵敏度高等 优点[59]。 3临床应用 3.1早期诊断 对cfDNA进行定量分析可用于评估肿瘤负荷。肿瘤患者血浆中cfDNA含量明显高于健康 人或良性疾病患者，且随着肿瘤分期的增加而增加[60,61]。此外，cDNA的检测可用于确 定患者术后是否为无病生存，监测术后复发[60-62]。虽然cDNA提供的信息有限，但将 cfDNA水平与ctDNA体细胞突变相结合，则可提供宝贵的诊断信息。体细胞突变是肿瘤特 异性的，相比常规肿瘤标志物如癌胚抗原，评估cDNA体细胞突变对肿瘤的诊断将更加准 确。另外，研究证实肿瘤候选基因突变谱在肿瘤组织和配对的血浆DNA样本之间是高度一 致的，包括NSCLC、乳腺癌、结肠癌等[63-65]。因此，cfDNA/ctDNA具有诊断和评估肿 瘤预后的价值。 3.2评估疾病对治疗的反应及监测耐药 ctDNA的分析可用于监测NSCLC对靶向治疗的反应。EGFR敏感突变的晚期NSCLC接受 EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(yrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗1个周期后，96%的患者 含有EGFR突变的ctDNA水平降低，这反映了对EGFR-TKIs的敏感性，也提供了治疗反 应的早期指征；通过ctDNA监测，在临床疾病进展前即检出EGFR-TKIs获得性耐药突变 T790M[66]。Wang等[67]在2017年世界肺癌大会公布的Benefit研究结果再次证实了 上述结论：EGFR-TKIs治疗8周后，如ctDNA中EGFR突变未被清除则表明患者对TKIs 效果不佳；而通过液态活检进行动态监测，可早于影像学进展2个月发现T790M耐药突 变。通过ctDNA测序可以发现第三代EGFR-TK的耐药机制，如C797S突变等[66)]。 化疗一直缺乏疗效预测的有效标志物，Jiang等[68]通过cfDNA测序发现cfDNA的突变 谱对于预测一线含铂双药化疗的疗效具有潜在的临床价值，且对于基线水平即存在TP53 突变的患者而言，监测TP53分子突变负荷对于监测化疗疗效有一定价值。 4结语和展望

技术，将 PCR 所需的反应体系分馏为 2 万个微滴，每个含有靶片段的微滴将发生扩增反 应，通过阳性微滴数进行靶基因突变拷贝数的定量分析 [56]。QuantStudio 3D dPCR 以封闭 的芯片为基础，相较于其他 dPCR 平台，其成本低廉 [57]。目前，dPCR 技术仅作为单基因 突变检测的一项重要补充，需在临床试验中进一步验证技术准确性与稳定性，以便在临床上 普及推广。 （4）NGS ：即高通量测序技术，其原理是将待测 DNA 分子打断成若干个小片段，并于两 端加上接头，单个片段进行扩增，复制碱基的同时检测信号。根据检测的基因数量和类型可 以分为靶向 panel 测序、全外显子测序（whole exome sequencing，WES）、全基因组测序 （whole genome sequencing，WGS）及转录组测序等。NGS 的流程一般为：样本制备、建 库、靶向富集、高通量测序以及生物信息学分析 [58]。NGS 可对数以百万计的 DNA 分子 同时进行测序，允许检测多个已知或未知的基因变异，具有对样本含量要求低、灵敏度高等 优点 [59]。 3 临床应用 3.1 早期诊断 对 cfDNA 进行定量分析可用于评估肿瘤负荷。肿瘤患者血浆中 cfDNA 含量明显高于健康 人或良性疾病患者，且随着肿瘤分期的增加而增加 [60,61]。此外，cfDNA 的检测可用于确 定患者术后是否为无病生存，监测术后复发 [60-62]。虽然 cfDNA 提供的信息有限，但将 cfDNA 水平与 ctDNA 体细胞突变相结合，则可提供宝贵的诊断信息。体细胞突变是肿瘤特 异性的，相比常规肿瘤标志物如癌胚抗原，评估 ctDNA 体细胞突变对肿瘤的诊断将更加准 确。另外，研究证实肿瘤候选基因突变谱在肿瘤组织和配对的血浆 DNA 样本之间是高度一 致的，包括 NSCLC、乳腺癌、结肠癌等 [63-65]。因此，cfDNA/ctDNA 具有诊断和评估肿 瘤预后的价值。 3.2 评估疾病对治疗的反应及监测耐药 ctDNA 的分析可用于监测 NSCLC 对靶向治疗的反应。EGFR 敏感突变的晚期 NSCLC 接受 EGFR- 酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治疗 1 个周期后，96% 的患者 含有 EGFR 突变的 ctDNA 水平降低，这反映了对 EGFR-TKIs 的敏感性，也提供了治疗反 应的早期指征；通过 ctDNA 监测，在临床疾病进展前即检出 EGFR-TKIs 获得性耐药突变 T790M[66]。Wang 等 [67] 在 2017 年世界肺癌大会公布的 Benefit 研究结果再次证实了 上述结论：EGFR-TKIs 治疗 8 周后，如 ctDNA 中 EGFR 突变未被清除则表明患者对 TKIs 效果不佳；而通过液态活检进行动态监测，可早于影像学进展 2 个月发现 T790M 耐药突 变。通过 ctDNA 测序可以发现第三代 EGFR-TKI 的耐药机制，如 C797S 突变等 [66]。 化疗一直缺乏疗效预测的有效标志物，Jiang 等 [68] 通过 cfDNA 测序发现 cfDNA 的突变 谱对于预测一线含铂双药化疗的疗效具有潜在的临床价值，且对于基线水平即存在 TP53 突变的患者而言，监测 TP53 分子突变负荷对于监测化疗疗效有一定价值。 4 结语和展望

随着肿瘤发生发展机制、耐药机制及肿瘤微环境调控机制等的不断阐明，液态活检在临床领 域的应用也将越来越广泛，可以为早期诊断筛查、疗效监测、预后评估及指导用药等方面提 供重要依据。靶向治疗的全程管理与液态活检的动态监测密不可分，免疫治疗作为肺癌领域 最具前景的研究方向，通过液态活检评估肿瘤突变负荷、肿瘤新生抗原等也可能为免疫治疗 提供有效的生物标志物。因此，液态活检技术的不断发展和应用，将成为肿瘤精准治疗的重 要组成部分

随着肿瘤发生发展机制、耐药机制及肿瘤微环境调控机制等的不断阐明，液态活检在临床领 域的应用也将越来越广泛，可以为早期诊断筛查、疗效监测、预后评估及指导用药等方面提 供重要依据。靶向治疗的全程管理与液态活检的动态监测密不可分，免疫治疗作为肺癌领域 最具前景的研究方向，通过液态活检评估肿瘤突变负荷、肿瘤新生抗原等也可能为免疫治疗 提供有效的生物标志物。因此，液态活检技术的不断发展和应用，将成为肿瘤精准治疗的重 要组成部分