实验九动物细胞培养 Dr.Tian 2002
实验九 动物细胞培养
一、实验目的 ·掌握无菌操作 ·掌握原代和传代细胞培养； ·了解培养成纤维细胞的形态。 Dr.Tian 2002
一、实验目的 • 掌握无菌操作； • 掌握原代和传代细胞培养； • 了解培养成纤维细胞的形态
二、实验原理 ·原代培养：培养直接来自动物机体的细胞群，将 细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传 代或传代培养。 ·细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定 性质或标志的细胞群。 细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过 程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 Dr.Tian 2002
• 原代培养 ：培养直接来自动物机体的细胞群，将 细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传 代或传代培养。 • 细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定 性质或标志的细胞群。 • 细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过 程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 二、实验原理
三、实验器材与试剂 ·1.器具 ·显微镜、电热恒温水浴锅、天平、CO2培养箱、 蒸汽灭菌器、超净工作台、解剖刀、眼科剪、眼 科镊、培养皿、锥形瓶、容量瓶、纱布、培养瓶、 移液枪。 ·2.材料 ·9-12日龄发育良好的鸭胚。 Dr.Tian 2002
三、实验器材与试剂 • 1. 器具 • 显微镜、电热恒温水浴锅、天平、CO2培养箱、 蒸汽灭菌器、超净工作台、解剖刀、 眼科剪、眼 科镊、培养皿 、锥形瓶、容量瓶、纱布、培养瓶、 移液枪。 • 2. 材料 • 9 - 12 日龄发育良好的鸭胚
·3.主要试剂 。双蒸水、Hank's液、0.25%胰蛋白酶、 EDTA、NaHCO3、台盼蓝、洋红。 ·营养液：DMEM培养基（含8%小牛血清、 1万单位/ml青、链霉素)。 ·维持液：DMEM培养基（含5%小牛血清、 1万单位ml青、链霉素)。 Dr.Tian 2002
• 3. 主要试剂 • 双蒸水、Hank’s液、0.25%胰蛋白酶、 EDTA、NaHCO3 、台盼蓝、洋红。 • 营养液：DMEM培养基（含8%小牛血清、 1万单位/ml青、链霉素）。 • 维持液： DMEM培养基（含5%小牛血清、 1万单位/ml青、链霉素）
四、原代培养 ·1.酒精棉球消毒鸭蛋，剥出鸭胚，去头、翅、爪和内脏，加Hank's 液，剪碎为0.5-1mm3的小块，Hank's液洗涤2-3次。 ·2.组织块移入培养瓶，间距0.5c摆放后倒置培养瓶，加少量营养液， 保持湿润，37℃培养，2r后翻转培养瓶，添营养液继续培养。 ·3.定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色变黄，说明细胞生长，3-5天 后更换培养液。 。4.倒置显微镜下观察拍照。 ·5.单层细胞用Hank's液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持。 Dr.Tian 2002
四、原代培养 • 1.酒精棉球消毒鸭蛋，剥出鸭胚，去头、翅、爪和内脏， 加Hank’s 液，剪碎为0. 5 -1mm3 的小块， Hank’s 液洗涤2 - 3 次。 • 2. 组织块移入培养瓶，间距0.5cm摆放后倒置培养瓶，加少量营养液， 保持湿润，37 ℃培养，2hr后翻转培养瓶，添营养液继续培养。 • 3. 定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色变黄，说明细胞生长，3-5天 后更换培养液。 • 4 .倒置显微镜下观察拍照。 • 5.单层细胞用Hank’s 液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持
五、传代培养 ·当培养细胞接近汇合成片时，倾去培养液。 ·加入0.25%（含0.02%EDTA)消化2-3分钟，倾去大部 分消化液，留少量消化液浸润细胞。发现细胞层出现裂痕 或空洞后，加入Hank's液洗去残留消化液，终止消化。 ·加适量营养液吹打分散，补加营养液后，1：2分装培养。 ·汇合后挑取少许细胞，染色，观察拍照。 Dr.Tian 2002
五、传代培养 • 当培养细胞接近汇合成片时，倾去培养液。 • 加入0. 25 %（含0. 02 %EDTA ）消化2-3分钟，倾去大部 分消化液，留少量消化液浸润细胞。发现细胞层出现裂痕 或空洞后，加入Hank’s 液洗去残留消化液，终止消化。 • 加适量营养液吹打分散，补加营养液后，1：2分装培养。 • 汇合后挑取少许细胞，染色，观察拍照
原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片
原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片
传代培养的绍鸭成纤维细胞形态(DAPI染色 正常细胞 凋亡细胞 分裂中期细胞 Dr.Tian 2002
正常细胞 凋亡细胞 分裂中期细胞 传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）
六、作业 ·1.细胞培养过程中应该注意哪些事项？ 。2.描绘培养成纤维细胞的形态（或提供照 片)。 Dr.Tian 2002
六、作业 • 1. 细胞培养过程中应该注意哪些事项？ • 2. 描绘培养成纤维细胞的形态（或提供照 片）