制各结合物时所用抗体一般均为纯度较高的【g心，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲 和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果 本底浅淡。如用下(b')2进行标记，则更可避免标本中F的干扰。在LISA中用酶标抗原的模式不 多，总的要求是抗原必须是高纯度的。 3.2.3结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 (1)戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性 磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入醇与抗体的 混合物中，反应后即得酶标记抗体。 LISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优 点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶 与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多 余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法 的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1：1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善 以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。 (2)过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时， 过碘酸钠将RP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。 酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是R即最可 取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。 按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般 不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但 游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的 量。因此制备的爵结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多， 分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除 留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析 或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离南、游离抗 体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。 结合物制得后，在用作ELIS试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济， 又可使本底增高：结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。 最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度， 制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的 IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲 和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果 本底浅淡。如用 F(ab')2 进行标记，则更可避免标本中 RF 的干扰。在 ELISA 中用酶标抗原的模式不 多，总的要求是抗原必须是高纯度的。 3.2.3 结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性 磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的 混合物中，反应后即得酶标记抗体。 ELISA 中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达 60%-70%）和重复性好等优 点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶 与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多 余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法 的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以 1:1 的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善 以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。 （2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时， 过碘酸钠将 HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成 Schiff 氏碱而结合。 酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是 HRP 最可 取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。 按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般 不影响 ELISA 中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但 游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的 量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多， 分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除 留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析 或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗 体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。 结合物制得后，在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济， 又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。 最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度