当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底， 不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同 样也吸附在固相表面，业己起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见 2.2.2)。包被好的LISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。 3.2结合物 结合物即酶标记的抗体（或抗原），是LIS中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化 活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例， 在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物 尚要有良好的稳定性。 3.2.1酶 用于LISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富， 价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同 的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低震，有色产物易于测定等。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,RP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase,,AP)。在少数商品LISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、B-D-半乳糖苷酶和脲 酶等。 国产LISA试剂一般都用P制备结合物。RP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000， 是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色 糖蛋白在275m波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403m波长处有最高吸收峰。 HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl,德文，意为纯度数)表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之 比，高纯度的R即的z≥？.0。 R即除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是， 在选用酶制剂时，除其纯度2外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶 制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。 国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记醇。常用的AP有两个来源，分别从大肠杆菌利 小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆茵中提取的AP分子量为80000， 酶作用的最适合H为8.0：用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000，最适为9.6。在ELISA中， AP系统的敏感度一般高于RP系统，空白值也较低，但AP价格品贵，制备结合物所得率也较HRP 低。 3.2.2抗原和抗体当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底， 不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同 样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见 2.2.2）。包被好的 ELISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。 3.2 结合物 结合物即酶标记的抗体（或抗原），是 ELISA 中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化 活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例， 在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物 尚要有良好的稳定性。 3.2.1 酶 用于 ELISA 的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富， 价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同 的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在 ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品 ELISA 试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲 酶等。 国产 ELISA 试剂一般都用 HRP 制备结合物。HRP 是一种糖蛋白，含糖量约为 18%，分子量为 44000， 是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色 糖蛋白在 275nm 波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在 403nm 波长处有最高吸收峰。 HRP 的纯度用 RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是 403nm 的吸光度与 280nm 吸光度之 比，高纯度的 HRP 的 RZ≥?.0。 HRP 除符合上述的 ELISA 中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是， 在选用酶制剂时，除其纯度 RZ 外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶 制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。 国外很多 ELISA 试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的 AP 有两个来源，分别从大肠杆菌和 小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的 AP 分子量为 80000， 酶作用的最适合 pH 为 8.0；用小牛肠膜中提取的 AP 分子量为 100000，最适 pH 为 9.6。在 ELISA 中， AP 系统的敏感度一般高于 HRP 系统，空白值也较低，但 AP 价格昂贵，制备结合物所得率也较 HRP 低。 3.2.2 抗原和抗体