于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清 白蛋白质(BSA)等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽 抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体 产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发 生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。 3.1.4包被用抗体 包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。 如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法） 后才能用于ELISA.,以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG,通常采用硫酸 铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的Ig已可用于包被，高度纯化的IgG性质 不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含 量较多的非特异性【gG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处 理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一 种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。 3.1.5包被的条件 包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的H等应根据试验的特点和材料的性质 而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用p9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用7.2的磷酸盐缓 冲液及pH78的Tris-HQ.缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱 中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的 性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为 100ng/ml-20ug/ml. 3.1.6 封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的 浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空 隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭 剂是0.05%-0.%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是 种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用(%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直 接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制 备中较少应用。 封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的LIS固相均需封闭，封闭不 于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清 白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽 抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体 产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发 生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。 3.1.4 包被用抗体 包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。 如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法） 后才能用于 ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取 IgG，通常采用硫酸 铵盐析和 Sephadex 凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的 IgG 已可用于包被，高度纯化的 IgG 性质 不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含 量较多的非特异性 IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处 理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的 IgG。应用单抗包被时应注意，一 种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。 3.1.5 包被的条件 包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的 pH 等应根据试验的特点和材料的性质 而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用 pH7.2 的磷酸盐缓 冲液及 pH7~8 的 Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在 4-8℃冰箱 中放置过夜，37℃中保温 2 小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的 性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为 100ng/ml-20ug/ml。 3.1.6 封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的 浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空 隙，从而排斥在 ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭 剂是 0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用 10%的小牛血清或 1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一 种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直 接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制 备中较少应用。 封闭是否必要，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件。并非所有的 ELISA 固相均需封闭，封闭不