达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应 抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一R即：抗人gG制剂标明的工 作浓度为1：5000，表示该制剂经1：5000稀释后，在与人1gG包被的固相作ELISA试验时，将发生 阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗 原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下 进行“滴配“选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。 3.2.4结合物的保存 酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻 干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为 不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的 LIS试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释 度稀释成工作液。现在较先进的LISA试剂盒均己用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀 释，在48℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外 再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂(R即结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠)，以防止细 菌生长。 3.2.5结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓 冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般 还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20,0.05%的浓度较为适宜。 在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。 3.3酶的底物 3.3.1HRP的底物 R即催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为202，其反应式如下： DH2+H202D+H20 上式中，D2为供氧体，H2O2为受氢体。在LISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有 色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate--6)]。 0D氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492m处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便， 是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HC为水溶性。曾有报道0PD有致异变性，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应 抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一 HRP：抗人 IgG 制剂标明的工 作浓度为 1:5000，表示该制剂经 1:5000 稀释后，在与人 IgG 包被的固相作 ELISA 试验时，将发生 阳性反应。但在用于具体的 ELISA 检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗 原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下 进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。 3.2.4 结合物的保存 酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻 干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为 不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的 ELISA 试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见 3.2.5）临用时按标明的稀释 度稀释成工作液。现在较先进的 ELISA 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀 释，在 4-8℃保存期可达 6 个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外 再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP 结合物加硫柳泵，AP 结合物可加叠氮钠），以防止细 菌生长。 3.2.5 结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓 冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如 1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般 还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温 20，0.05%的浓度较为适宜。 在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。 3.3 酶的底物 3.3.1 HRP 的底物 HRP 催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为 H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2 为供氧体，H2O2 为受氢体。在 ELISA 中，DH2 一般为无色化合物，经酶作用后成为有 色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) 和 ABTS[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。 OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在 492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便， 是 HRP 结合物最常用的底物。OPD 本身难溶于水，OPD·2HCL 为水溶性。曾有报道 OPD 有致异变性