技术，将PC所需的反应体系分馏为2万个微滴，每个含有靶片段的微滴将发生扩增反 应，通过阳性微滴数进行靶基因突变拷贝数的定量分析[56)]。QuantStudio3 D dPCR以封闭 的芯片为基础，相较于其他dPCR平台，其成本低廉[57刀。目前，dPCR技术仅作为单基因 突变检测的一项重要补充，需在临床试验中进一步验证技术准确性与稳定性，以便在临床上 普及推广。 (4)NGS:即高通量测序技术，其原理是将待测DNA分子打断成若干个小片段，并于两 端加上接头，单个片段进行扩增，复制碱基的同时检测信号。根据检测的基因数量和类型可 以分为靶向panel测序、全外显子测序(whole exome sequencing,WES)、全基因组测序 (whole genome sequencing,.WGS)及转录组测序等。NGS的流程一般为：样本制备、建 库、靶向富集、高通量测序以及生物信息学分析[58]。NGS可对数以百万计的DNA分子 同时进行测序，允许检测多个已知或未知的基因变异，具有对样本含量要求低、灵敏度高等 优点[59]。 3临床应用 3.1早期诊断 对cfDNA进行定量分析可用于评估肿瘤负荷。肿瘤患者血浆中cfDNA含量明显高于健康 人或良性疾病患者，且随着肿瘤分期的增加而增加[60,61]。此外，cDNA的检测可用于确 定患者术后是否为无病生存，监测术后复发[60-62]。虽然cDNA提供的信息有限，但将 cfDNA水平与ctDNA体细胞突变相结合，则可提供宝贵的诊断信息。体细胞突变是肿瘤特 异性的，相比常规肿瘤标志物如癌胚抗原，评估cDNA体细胞突变对肿瘤的诊断将更加准 确。另外，研究证实肿瘤候选基因突变谱在肿瘤组织和配对的血浆DNA样本之间是高度一 致的，包括NSCLC、乳腺癌、结肠癌等[63-65]。因此，cfDNA/ctDNA具有诊断和评估肿 瘤预后的价值。 3.2评估疾病对治疗的反应及监测耐药 ctDNA的分析可用于监测NSCLC对靶向治疗的反应。EGFR敏感突变的晚期NSCLC接受 EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(yrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗1个周期后，96%的患者 含有EGFR突变的ctDNA水平降低，这反映了对EGFR-TKIs的敏感性，也提供了治疗反 应的早期指征；通过ctDNA监测，在临床疾病进展前即检出EGFR-TKIs获得性耐药突变 T790M[66]。Wang等[67]在2017年世界肺癌大会公布的Benefit研究结果再次证实了 上述结论：EGFR-TKIs治疗8周后，如ctDNA中EGFR突变未被清除则表明患者对TKIs 效果不佳；而通过液态活检进行动态监测，可早于影像学进展2个月发现T790M耐药突 变。通过ctDNA测序可以发现第三代EGFR-TK的耐药机制，如C797S突变等[66)]。 化疗一直缺乏疗效预测的有效标志物，Jiang等[68]通过cfDNA测序发现cfDNA的突变 谱对于预测一线含铂双药化疗的疗效具有潜在的临床价值，且对于基线水平即存在TP53 突变的患者而言，监测TP53分子突变负荷对于监测化疗疗效有一定价值。 4结语和展望技术，将 PCR 所需的反应体系分馏为 2 万个微滴，每个含有靶片段的微滴将发生扩增反 应，通过阳性微滴数进行靶基因突变拷贝数的定量分析 [56]。QuantStudio 3D dPCR 以封闭 的芯片为基础，相较于其他 dPCR 平台，其成本低廉 [57]。目前，dPCR 技术仅作为单基因 突变检测的一项重要补充，需在临床试验中进一步验证技术准确性与稳定性，以便在临床上 普及推广。 （4）NGS ：即高通量测序技术，其原理是将待测 DNA 分子打断成若干个小片段，并于两 端加上接头，单个片段进行扩增，复制碱基的同时检测信号。根据检测的基因数量和类型可 以分为靶向 panel 测序、全外显子测序（whole exome sequencing，WES）、全基因组测序 （whole genome sequencing，WGS）及转录组测序等。NGS 的流程一般为：样本制备、建 库、靶向富集、高通量测序以及生物信息学分析 [58]。NGS 可对数以百万计的 DNA 分子 同时进行测序，允许检测多个已知或未知的基因变异，具有对样本含量要求低、灵敏度高等 优点 [59]。 3 临床应用 3.1 早期诊断 对 cfDNA 进行定量分析可用于评估肿瘤负荷。肿瘤患者血浆中 cfDNA 含量明显高于健康 人或良性疾病患者，且随着肿瘤分期的增加而增加 [60,61]。此外，cfDNA 的检测可用于确 定患者术后是否为无病生存，监测术后复发 [60-62]。虽然 cfDNA 提供的信息有限，但将 cfDNA 水平与 ctDNA 体细胞突变相结合，则可提供宝贵的诊断信息。体细胞突变是肿瘤特 异性的，相比常规肿瘤标志物如癌胚抗原，评估 ctDNA 体细胞突变对肿瘤的诊断将更加准 确。另外，研究证实肿瘤候选基因突变谱在肿瘤组织和配对的血浆 DNA 样本之间是高度一 致的，包括 NSCLC、乳腺癌、结肠癌等 [63-65]。因此，cfDNA/ctDNA 具有诊断和评估肿 瘤预后的价值。 3.2 评估疾病对治疗的反应及监测耐药 ctDNA 的分析可用于监测 NSCLC 对靶向治疗的反应。EGFR 敏感突变的晚期 NSCLC 接受 EGFR- 酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治疗 1 个周期后，96% 的患者 含有 EGFR 突变的 ctDNA 水平降低，这反映了对 EGFR-TKIs 的敏感性，也提供了治疗反 应的早期指征；通过 ctDNA 监测，在临床疾病进展前即检出 EGFR-TKIs 获得性耐药突变 T790M[66]。Wang 等 [67] 在 2017 年世界肺癌大会公布的 Benefit 研究结果再次证实了 上述结论：EGFR-TKIs 治疗 8 周后，如 ctDNA 中 EGFR 突变未被清除则表明患者对 TKIs 效果不佳；而通过液态活检进行动态监测，可早于影像学进展 2 个月发现 T790M 耐药突 变。通过 ctDNA 测序可以发现第三代 EGFR-TKI 的耐药机制，如 C797S 突变等 [66]。 化疗一直缺乏疗效预测的有效标志物，Jiang 等 [68] 通过 cfDNA 测序发现 cfDNA 的突变 谱对于预测一线含铂双药化疗的疗效具有潜在的临床价值，且对于基线水平即存在 TP53 突变的患者而言，监测 TP53 分子突变负荷对于监测化疗疗效有一定价值。 4 结语和展望