2液态活检的相关技术 2.1液态活检的捕获技术 (I)分离游离核酸：从血液中分离ctDNA与RNA的常用方法是通过商品化试剂盒来提 取，提取ctDNA应用较为成熟的试剂盒为Qiagen公司的产品，提取RNA常用试剂盒为 SPLIT RNA Extr action Kit[47] (2)富集和捕获CTC:CTC的富集主要基于CTC的物理学（大小、密度、电极、可变形 性等)和生物学（细胞表面蛋白、生存能力及侵袭性）特征，基于物理学特征的富集方法包 括滤膜法、密度梯度离心法或二维电泳法；基于生物学特征的方法主要是免疫磁珠法，即通 过CTC表面的上皮细胞抗原EpCAM进行正向富集，或者基于白细胞表面的CD45抗原 进行负向富集[48,49]。目前CTC富集捕获技术见表1。 (3)分离外泌体：分离外泌体常用的方法是密度梯度超速离心法，或根据外泌体表面特异 性标志物CD9、CD63、CD81等进行富集[50,51]。 2.2液态活检的检测技术 液态活检常用的检测技术包括以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为基础的 检测技术，如突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)、 Cobas-PCR、数字PCR(digital PCR,dPCR)及二代测序(next generation sequencing,NGS) 技术等。检测技术的发展进一步推动了液态活检在临床上的应用，本文将简要介绍国内常用 的检测技术。 (1)ARMS-PCR:Newton等[52]最早建立了ARMS-PCR方法检测已知的突变位点。其 原理是根据特异的突变位点设计引物，仅目的片段存在突变才可进行PC扩增，产生荧光 信号，同时阻滞野生型基因的PCR扩增反应。与其他基于PCR的检测技术相比，ARMS- PCR在检测单个已知突变位点时灵敏度更高(1%)，更便捷。ARMS-PCR的升级技术super ARMS-PCR,其灵敏度进一步提升，可达O.2%,更适用于血液表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,.EGFR)突变的检测[53,54。目前，ARMS-PCR和super ARMS-PCR 均已获得国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration,CFDA)批准用 于晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)检测EGFR突变，指导临床靶向 用药。 (2)Cobas-PCR:是另一种基于等位基因特异性扩增的实时荧光PCR,其对引物做了进一 步修饰，导致引物与野生型片段结合时极不稳定，从而降低假阳性率，其第二代技术C0bs V2.0可同时检测组织和血液样本，并增加EGFR突变检测位点至42个[55]。 (3)dPCR:用于血液EGFR突变检测的数字PCR技术主要包括微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和QuantStudio3 dPCR,灵敏度约为O.Ol%。ddPCR基于乳液微滴2 液态活检的相关技术 2.1 液态活检的捕获技术 （1）分离游离核酸：从血液中分离 ctDNA 与 RNA 的常用方法是通过商品化试剂盒来提 取，提取 ctDNA 应用较为成熟的试剂盒为 Qiagen 公司的产品，提取 RNA 常用试剂盒为 SPLIT RNA Extr action Kit[47]。 （2）富集和捕获 CTC ：CTC 的富集主要基于 CTC 的物理学（大小、密度、电极、可变形 性等）和生物学（细胞表面蛋白、生存能力及侵袭性）特征，基于物理学特征的富集方法包 括滤膜法、密度梯度离心法或二维电泳法；基于生物学特征的方法主要是免疫磁珠法，即通 过 CTC 表面的上皮细胞抗原 EpCAM 进行正向富集，或者基于白细胞表面的 CD45 抗原 进行负向富集 [48,49]。目前 CTC 富集捕获技术见表 1。 （3）分离外泌体：分离外泌体常用的方法是密度梯度超速离心法，或根据外泌体表面特异 性标志物 CD9、CD63、CD81 等进行富集 [50,51]。 2.2 液态活检的检测技术 液态活检常用的检测技术包括以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的 检测技术，如突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）、 Cobas-PCR、数字 PCR（digital PCR，dPCR）及二代测序（next generation sequencing，NGS） 技术等。检测技术的发展进一步推动了液态活检在临床上的应用，本文将简要介绍国内常用 的检测技术。 （1）ARMS-PCR ：Newton 等 [52] 最早建立了 ARMS-PCR 方法检测已知的突变位点。其 原理是根据特异的突变位点设计引物，仅目的片段存在突变才可进行 PCR 扩增，产生荧光 信号，同时阻滞野生型基因的 PCR 扩增反应。与其他基于 PCR 的检测技术相比，ARMS￾PCR 在检测单个已知突变位点时灵敏度更高（1%），更便捷。ARMS-PCR 的升级技术 super ARMS-PCR，其灵敏度进一步提升，可达 0.2%，更适用于血液表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的检测 [53,54]。目前，ARMS-PCR 和 super ARMS-PCR 均已获得国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）批准用 于晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）检测 EGFR 突变，指导临床靶向 用药。 （2）Cobas-PCR ：是另一种基于等位基因特异性扩增的实时荧光 PCR，其对引物做了进一 步修饰，导致引物与野生型片段结合时极不稳定，从而降低假阳性率，其第二代技术 Cobas V2.0 可同时检测组织和血液样本，并增加 EGFR 突变检测位点至 42 个 [55]。 （3）dPCR ：用于血液 EGFR 突变检测的数字 PCR 技术主要包括微滴数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和 QuantStudio 3D dPCR，灵敏度约为 0.01%。ddPCR 基于乳液微滴