等体积预冷至一20℃的95%乙醇,同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10 分钟,以沉淀完全。于4℃,1000rpm,离心10min,倾去上清,并滴干,沉淀保存于 离心管中,盖上盖子或薄膜封口,然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“醇级分Ⅲ”) 废弃上清液之前,要用尿糖试纸检査其酶活性(于下一个实验一起做) (二)离子交换柱层析纯化蔗糖酶 、试剂 1.DEAE纤维素:DE-231.5克 2.0.5N NaOH 100ml 3.0.5N HCL 50ml 4.0.02mol/LpH7.3 Tris-HCI缓冲液250ml 5.0.02mo/LpH73(含0.2mol/L浓度NaCl)的 Tris-HCl缓冲液50ml 二、仪器 1.层析柱 2.部分收集器 3.磁力搅拌器及搅拌子 4.50m小烧杯2个 5.玻璃砂漏斗 6.真空泵与抽滤瓶 7.精密pH试纸或pH计 8.三通管 9.止水夹 10.吸耳球 11.塑料紫外比色杯 12.电导率仪 13.尿糖试纸 14.点滴板 三、操作步骤 1.离子交换剂的处理 称取15克DEAE纤维素(DE-23)干粉,加入0.5 mol/L Naoh溶液(约50ml), 轻轻搅拌,浸泡至少0.5小时(不超过1小时),用玻璃砂漏斗抽滤,并用去离子水洗至 近中性,抽干后,放入小烧杯中,加50m10.5 mol/L HCl,搅匀,浸泡05小时,同上 用去离子水洗至近中性,再用0.5 molL Naoh重复处理一次,用去离子水洗至近中性后, 抽干备用。(因DEAE纤维素昂贵,用后务必回收)。实际操作时,通常纤维素是已浸泡 过回收的,按“碱→酸”的顺序洗即可,因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过 滤困难,可以先浮选除去细颗粒,抽干后用05 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl溶液处理 然后水洗至中性 2.装柱与平衡:225 等体积预冷至－20℃的 95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需 30 分钟，再在冰盐浴中放置 10 分钟，以沉淀完全。于 4℃，10000rpm，离心 10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于 离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。 废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。 （二）离子交换柱层析纯化蔗糖酶 一、试剂 1. DEAE 纤维素：DE-23 1.5 克 2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml 4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液 250ml 5. 0.02 mol/L pH7.3（含 0.2 mol/L 浓度 NaCl）的 Tris-HCl 缓冲液 50ml 二、仪器 1. 层析柱 2. 部分收集器 3. 磁力搅拌器及搅拌子 4. 50ml 小烧杯 2 个 5. 玻璃砂漏斗 6. 真空泵与抽滤瓶 7. 精密 pH 试纸或 pH 计 8. 三通管 9. 止水夹 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 电导率仪 13. 尿糖试纸 14. 点滴板 三、操作步骤 1. 离子交换剂的处理： 称取 1.5 克 DEAE 纤维素（DE-23）干粉，加入 0.5mol/L NaOH 溶液（约 50ml）， 轻轻搅拌，浸泡至少 0.5 小时（不超过 1 小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至 近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡 0.5 小时，同上， 用去离子水洗至近中性，再用 0.5 mol/L NaOH 重复处理一次，用去离子水洗至近中性后， 抽干备用。（因 DEAE 纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡 过回收的，按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过 滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用 0.5 mol/L NaOH－0.5 mol/L NaCl 溶液处理， 然后水洗至中性。 2. 装柱与平衡：