先将层析柱垂直装好,在烧杯内用002 mol/L pH7.3 Tris-HCI缓冲液洗纤维素几 次,用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱,然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率 与缓冲液相同或接近时即可上样 3.上样与洗脱: 上样前先准备好梯度洗脱液,本实验采用20ml0.02MpH7.3的 Tris-HCI缓冲液和 20ml含02M浓度NaCl的0.02 mol/L pH73的 Tris-HCI缓冲液,进行线性梯度洗脱。取 两个相同直径的50ml小烧杯,一个装20m含NaCl的高离子强度溶液,另一个装入20ml 低离子强度溶液,放在磁力搅拌器上,在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子(在 细塑料管内放入一小段铁丝,两端用酒精灯加热封口),将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁 的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中,上端接一段乳胶管,夹上止水夹,用吸耳球小心 地将溶液吸入三通(轻轻松一下止水夹),立即夹紧乳胶管,使两烧杯溶液形成连通, 注意两个烧杯要放妥善,切勿使一杯高、一杯低 用5ml0.02 mol/L pH7.3的 Tris-HCI缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ,(注意玻璃搅棒头必 须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤),若溶液混浊,则用小试管,4000pm离心除 去不溶物。取1.5m上清液(即醇级分Ⅲ样品,留待下一个实验测酶活力及蛋白含量), 将剩余的35m清液小心地加到层析柱上,不要扰动柱床,注意要从上样开始使用部分 收集器收集,每管2.5~30mJl0min。上样后用缓冲液洗两次,然后再用约20m缓冲液 洗去柱中未吸附的蛋白质,至A280降到0.1以下,夹住层析柱出口,将恒流泵入口的细 塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中,用胶布固定塑料管,接好层析 柱,打开磁力搅拌器,放开层析柱出口,开始梯度洗脱,连续收集洗脱液,两个小烧杯 中的洗脱液用尽后,为洗脱充分,也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小 烧杯继续洗脱,控制流速2.5~3,0 ml/10min。 测定每管洗脱液的A280光吸收值和电导率。(使用DJS-10电导电极) 测定不含NaCl的0.02 mol/L pH73 Tris-HCI缓冲液和含0.2moL浓度NaCl的 0.02mol/Lph73 Tris-HCI缓冲液的电导率,用电导率与NaCl浓度作图,利用此图将每 管所测电导率换算成NaCl浓度,并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度 4.各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内,加一滴02 mol/L pH49的乙酸缓冲液,一滴0.5moL蔗糖和 滴洗脱液,反应5分钟,在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸,10~20mi后观察试 纸颜色的变化。用“+”号的数目,表示颜色的深浅,即各管酶活力的大小。合并活性 最高的2~3管,量出总体积,并将其分成10份,分别倒入10个小试管,用保鲜膜封口, 冰冻保存,使用时取出一管。此即“柱级分IV”。 注意:从上样开始收集,可能有两个活性峰,梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附 物,本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰 在同一张图上画出所有管的酶活力,NaCl浓度(可用电导率代替)和光吸收值A280 的曲线和洗脱梯度线。226 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几 次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率 与缓冲液相同或接近时即可上样。 3. 上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用 20ml 0.02M pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液和 20ml 含 0.2M 浓度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液，进行线性梯度洗脱。取 两个相同直径的 50ml 小烧杯，一个装 20ml 含 NaCl 的高离子强度溶液，另一个装入 20ml 低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在 细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁 的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心 地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通， 注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用 5ml 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，（注意玻璃搅棒头必 须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm 离心除 去不溶物。取 1.5ml 上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量）， 将剩余的 3.5ml 清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分 收集器收集，每管 2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约 20ml 缓冲液 洗去柱中未吸附的蛋白质，至 A280 降到 0.1 以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细 塑料导管放入不含 NaCl 的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析 柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯 中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余 30ml 高离子强度洗脱液倒入小 烧杯继续洗脱，控制流速 2.5~3.0ml/10min。 测定每管洗脱液的 A280 光吸收值和电导率。（使用 DJS-10 电导电极） 测定不含 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 缓冲液和含 0.2mol/L 浓度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 缓冲液的电导率，用电导率与 NaCl 浓度作图，利用此图将每 管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内，加一滴 0.2mol/L pH4.9 的乙酸缓冲液，一滴 0.5mol/L 蔗糖和 一滴洗脱液，反应 5 分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min 后观察试 纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性 最高的 2~3 管，量出总体积，并将其分成 10 份，分别倒入 10 个小试管，用保鲜膜封口， 冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分 IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附 物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl 浓度（可用电导率代替）和光吸收值 A280 的曲线和洗脱梯度线