(三)蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法,了解各级分酶的纯化情况 、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法,必须测定各级分酶活性和比活。 测定蔗糖酶活性的方法有许多种,如费林试剂法、 Nelson's试剂法、水杨酸试剂法 等,本实验先使用费林试剂法,以后测米氏常数Km和最大反应速度Vm时再用 Nelson’s 试剂法。 费林试剂法灵敏度较高,但数据波动较大,因为反应后溶液的颜色随时间会有变化, 因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下,蔗糖酶催化蔗糖水解, 生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧 化,二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀,氧化亚铜与磷钼酸作用,生成兰色溶液,其 兰色深度与还原糖的量成正比,于650nm测定光吸收值。 三、试剂 1.碱性铜试剂(用毕回收) 称10g无水NaCO3,加入100ml去离子水溶解,另称1.88g酒石酸,用100m去离 子水溶解,混合二溶液,再加入1.13克结晶 CuSo,溶解后定容到250ml 2.磷钼酸试剂(用毕回收) 在烧杯内加入钼酸175g,钨酸钠25g,10%NaOH100ml,去离子水10ml,混合 后煮沸约30min(小心不要蒸干),驱去钼酸中存在的氨,直到无氨味为止,冷却后加 85%磷酸63m,混合并稀释到250ml。 3.025%苯甲酸200ml,配葡萄糖用,防止时间长溶液长菌,也可以用去离子水代替。 4.葡萄糖标准溶液: (1)贮液:精确称取无水葡萄糖(应在105℃恒重过)0.180克,以0.25%苯甲酸溶 液溶解后,定容到100ml容量瓶中(浓度10 mmol/L)。 (2)操作溶液:用移液管取贮液10m,置于50m容量瓶中,以用0.25%苯甲酸或去 离子水稀释至刻度(浓度为2mmo/L)。 5.0molL蔗糖溶液50ml,分装于小试管中冰冻保存,因蔗糖极易水解,用时取出 管化冻后摇匀 6.0.2moL乙酸缓冲液,pH49,200ml 7.牛血清清蛋白标准蛋白质溶液(浓度范围:200~50oμg/ml,精确配制50ml)。 8.考马斯亮兰G-250染料试剂,100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml95%乙醇后, 加入120ml85%磷酸,用去离子水稀释到1L(公用) 四、仪器 1.试管20支,试管架1个 2.秒表1块,或用手表。 3.移液管:0.1、0.2、2.0、50ml227 （三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 一、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。 二、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s 试剂法、水杨酸试剂法 等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax 时再用 Nelson’s 试剂法。 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化， 因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解， 生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧 化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其 兰色深度与还原糖的量成正比，于 650nm 测定光吸收值。 三、试剂 1. 碱性铜试剂（用毕回收） 称 10g 无水 NaCO3 ,加入 100ml 去离子水溶解，另称 1.88g 酒石酸，用 100ml 去离 子水溶解，混合二溶液，再加入 1.13 克结晶 CuSO4，溶解后定容到 250ml。 2. 磷钼酸试剂（用毕回收） 在烧杯内加入钼酸 17.5g，钨酸钠 2.5g，10% NaOH 100ml, 去离子水 100ml，混合 后煮沸约 30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加 85%磷酸 63ml,混合并稀释到 250ml。 3. 0.25%苯甲酸 200ml，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液： （1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在 105℃恒重过）0.1802 克，以 0.25%苯甲酸溶 液溶解后，定容到 100ml 容量瓶中（浓度 10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取贮液 10ml，置于 50ml 容量瓶中，以用 0.25%苯甲酸或去 离子水稀释至刻度（浓度为 2mmol/L）。 5. 0.2mol/L 蔗糖溶液 50ml，分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一 管化冻后摇匀。 6. 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。 7. 牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200～500g/ml，精确配制 50ml）。 8. 考马斯亮兰 G-250 染料试剂，100mg 考马斯亮兰 G-250 全溶于 50ml 95%乙醇后， 加入 120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到 1L（公用）。 四、仪器 1. 试管 20 支，试管架 1 个 2. 秒表 1 块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml