一、叶绿体的徒手切片观察 1.取新鲜的菠菜叶片，用刀片横向切削一个薄片，置于干净的载玻片上。 2.滴加1滴0.35M氯化钠溶液，加盖玻片，压片，使细胞平展。 3.置普通光学显微镜下观察，可以看到3种类型的细胞：边缘为锯齿形的鳞片状表皮 细胞：构成气孔的成对存在的肾形保卫细胞：排成删栏状的长形和椭圆形的叶肉细胞，内含 叶绿体，呈绿色微榄形。在高倍镜下可看到叶绿体中绿色的基粒。 4.在荧光显微镜下观察，选用B(blue)激发滤片、B双色镜和D(orange)阻断滤片，可观 察到叶绿体发出火红色荧光，气孔发出绿色荧光，保卫细胞的叶绿体呈火红色，围绕气孔排 成一圈。 5.揭下盖玻片，滴加1滴0.01%吖啶橙染液，染色2mi后，加盖玻片，吸去多余溶液， 压片，置荧光显微镜下观察。可观察到叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发绿色荧光。 二、叶绿体的分离提取与观察 1.取新鲜的菠菜叶片，洗净后吸干水分，去除叶梗及粗脉，称取1g样品，置于研钵 中，加入0.35M氯化钠溶液5ml,研磨匀浆。 2.取1.5ml匀浆液于1.5ml离心管中，在离心机中1000pm离心5mim。 3.将离心得到的上清液转入新的1.5ml离心管中，在离心机中3000pm离心5mim 4.弃去上清液，得到沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 5.沉淀用少量0.35M氯化钠溶液悬浮。 6.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片，压片后用普通光学显微镜观察。 7.将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 8.将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，染色2 min,盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 【实验结果与思考题】 】.绘图表示在普通光学显微镜下，徒手切片和分离叶绿体观察的情况 2.记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象。 3.分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 4.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？一、叶绿体的徒手切片观察 1. 取新鲜的菠菜叶片，用刀片横向切削一个薄片，置于干净的载玻片上。 2. 滴加 1 滴 0.35 M 氯化钠溶液，加盖玻片，压片，使细胞平展。 3. 置普通光学显微镜下观察，可以看到 3 种类型的细胞：边缘为锯齿形的鳞片状表皮 细胞；构成气孔的成对存在的肾形保卫细胞；排成删栏状的长形和椭圆形的叶肉细胞，内含 叶绿体，呈绿色橄榄形。在高倍镜下可看到叶绿体中绿色的基粒。 4. 在荧光显微镜下观察，选用 B(blue)激发滤片、B 双色镜和 O(orange)阻断滤片，可观 察到叶绿体发出火红色荧光，气孔发出绿色荧光，保卫细胞的叶绿体呈火红色，围绕气孔排 成一圈。 5. 揭下盖玻片，滴加 1 滴0.01%吖啶橙染液，染色 2 min后，加盖玻片，吸去多余溶液， 压片，置荧光显微镜下观察。可观察到叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发绿色荧光。 二、叶绿体的分离提取与观察 1. 取新鲜的菠菜叶片，洗净后吸干水分，去除叶梗及粗脉，称取 1 g 样品，置于研钵 中，加入 0.35 M 氯化钠溶液 5 ml，研磨匀浆。 2. 取 1.5 ml 匀浆液于 1.5 ml 离心管中，在离心机中 1000 rpm 离心 5 min。 3. 将离心得到的上清液转入新的 1.5 ml 离心管中，在离心机中 3000 rpm 离心 5 min。 4. 弃去上清液，得到沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 5. 沉淀用少量 0.35 M 氯化钠溶液悬浮。 6. 取叶绿体悬液 1 滴置于载玻片上，加盖玻片，压片后用普通光学显微镜观察。 7. 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 8. 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加 1 滴 0.01%吖啶橙荧光染料，染色 2 min，盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 【实验结果与思考题】 1. 绘图表示在普通光学显微镜下，徒手切片和分离叶绿体观察的情况。 2. 记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象。 3. 分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 4. 普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？ 16