实验七细胞内过氧化物酶的观察 【实验目的】 掌握细胞中过氧化物酶类的鉴定方法 【实验原理】 过氧化物酶类广泛存在于植物体中，主要包括过氧化物酶和过氧化氢酶。过氧化物酶是 活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发有 过程中它的活性不断发生变化，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。细胞中存 在的过氧化物酶能把许多胺类物质氧化成有色化合物，联苯胺可被细胞中的过氧化物酶氧化 成蓝色或者棕色络合物（蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可转变为棕色的联苯胺 踪)，从而显示出细胞内过氧化物酶的分布。过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。 细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢(H,0》,为了解除过氧化氢对细胞的毒害 细胞中的过氧化氢酶将其分解为水和氧气，对机体起保护作用。通过植物块茎与过氧化氢相 遇后发生的反应可间接证实该酶的存在。 过氧化物酶可以催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩 合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物 酶的底物，在过氧化物酶存在下，H,O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4邻甲氧基苯酚， 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其吸光度，即可求出该酶的活性， 【材料、器具与试剂】 (一)材料：马铃薯、洋葱根尖，玉米或水稻根系。 (二)器具：光学显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、刀片、牙签、载玻片、盖玻片、吸水纸、 量筒、烧杯、分光光度计、研钵、秒表、天平。 (三)试剂： 1.0.1%钼酸胺：取0.1g钼酸胺溶于100ml蒸馏水中。 2.1%联苯胺：取1.0g联苯胺溶于100ml蒸馏水中。 3.0.9%生理盐水：取NaC19.0g溶于1000ml蒸馏水中。 4.3%过氧化氢溶液：取过氧化氢溶液3.0m1,加入到97.0ml蒸馏水中。 5.0.1 M Tris-HC1缓冲液(pH8.5):取12.114g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加水稀释，用 HCI调pH至8.5，后定容1L。 6.0.2 M NaH:PO4贮备液：称取27.8 gNaH:PO4·HO,溶于蒸馏水中，定容至1L 7.0.2 M Na.HPO.贮各液：称取53.65 g Na.HPO,·7H,O或71.7 g Na.HPO4·12HO,溶 于蒸馏水中，定容至1L。 8.0.2M磷酸缓冲液(pH6.0):分别取0.2 MNaH.PO4贮备液87.7ml与0.2 M NaHaPO.4 备液12.3ml充分混匀并稀释至200ml。 9.反应混合液：取0.2M磷酸缓冲液(pH6.0)500ml,过氧化氢0.28ml,愈创木酚0.19 ml混合。 实验七 细胞内过氧化物酶的观察 【实验目的】 掌握细胞中过氧化物酶类的鉴定方法。 【实验原理】 过氧化物酶类广泛存在于植物体中，主要包括过氧化物酶和过氧化氢酶。过氧化物酶是 活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育 过程中它的活性不断发生变化，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。细胞中存 在的过氧化物酶能把许多胺类物质氧化成有色化合物，联苯胺可被细胞中的过氧化物酶氧化 成蓝色或者棕色络合物(蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可转变为棕色的联苯胺 腙)，从而显示出细胞内过氧化物酶的分布。过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。 细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢(H2O2)，为了解除过氧化氢对细胞的毒害， 细胞中的过氧化氢酶将其分解为水和氧气，对机体起保护作用。通过植物块茎与过氧化氢相 遇后发生的反应可间接证实该酶的存在。 过氧化物酶可以催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩 合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物 酶的底物，在过氧化物酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚， 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其吸光度，即可求出该酶的活性。 【材料、器具与试剂】 （一）材料：马铃薯、洋葱根尖，玉米或水稻根系。 （二）器具：光学显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、刀片、牙签、载玻片、盖玻片、吸水纸、 量筒、烧杯、分光光度计、研钵、秒表、天平。 （三）试剂： 1. 0.1%钼酸胺：取0.1 g钼酸胺溶于100 ml蒸馏水中。 2. 1%联苯胺：取1.0 g联苯胺溶于100 ml蒸馏水中。 3. 0.9%生理盐水：取NaC1 9.0 g溶于1000 ml蒸馏水中。 4. 3%过氧化氢溶液：取过氧化氢溶液3.0 m1，加入到97.0 ml蒸馏水中。 5. 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.5）：取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加水稀释，用 HCl调pH至8.5，后定容1 L。 6. 0.2 M NaH2PO4贮备液：称取27.8 g NaH2PO4·H2O，溶于蒸馏水中，定容至1 L。 7. 0.2 M Na2HPO4贮备液：称取53.65 g Na2HPO4·7H2O或71.7 g Na2HPO4·12H2O，溶 于蒸馏水中，定容至1 L。 8. 0.2 M磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取0.2 M NaH2PO4贮备液87.7 ml与0.2 M NaH2PO4贮 备液12.3 ml充分混匀并稀释至200 ml。 9. 反应混合液：取0.2 M磷酸缓冲液（pH6.0）500 ml，过氧化氢0.28 ml，愈创木酚0.19 ml混合。 17