基因工程原理实验指导 实验材料及试剂：水稻总DNA或BAC克隆DNA,琼脂糖，限制性内切酶 DraI,EcoRI,EcoRV HindIllI 实验步骤： 1.取10 ul DNA于0.8%凝胶检测： 2.将DNA调节浓度至300-400ngul 3,仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度 (10U-50U/如l)厂家配套试剂： 4.计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量：(0.5 ml tube中) DNA(3-5ug)10ul 10 x buffer reaction 1.5ul Enzyme(15U/l)0.8ul(冰上) ddH2O2.7ul 混匀，短暂离心 5.37℃温浴1-2hrs(纯DNA)或10hrs(粗制DNA); 6.加入上样缓冲液终止酶切反应，也可65℃加热10min使酶变性失活： 7.电泳检测酶切效率： 每个样品取110量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。 结果分析： 若水稻DNA呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则需重做 DNA被切烂：DNA降解，重新提DNA; DNA切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化： 若是BAC克隆DNA，酶切后应出现多条很清晰的不同大小DNA带。 思考： 什么是酶星活性？如何避免？ 影响酶切效率的因素？ EB指示剂原理？ 实验九电泳、转膜 转膜是把DNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定， 是进行各种后续研究（如RFLP分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂 交的研究)的前提。 实验目的：掌握Southern blotting的原理及操作步骤 实验原理： 1.转膜的方式： 向上的毛细管转移 向下的毛细管转移 基因工程原理实验指导 16 实验材料及试剂：水稻总 DNA 或 BAC 克隆 DNA ，琼脂糖，限制性内切酶 Dra I ， EcoRI ， EcoRV ， HindIII 实验步骤： 1．取 10µl DNA 于 0.8% 凝胶检测； 2．将 DNA 调节浓度至 300-400 ng/µl； 3．仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度 （ 10U-50U/µl ）厂家配套试剂； 4．计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量：（ 0.5 ml tube 中） DNA(3-5µg) 10µl 10 × buffer reaction 1.5µl Enzyme (15 U/µl) 0.8µl （冰上） ddH2O 2.7µl 混匀，短暂离心； 5．37 ℃ 温浴 1-2 hrs ( 纯 DNA) 或 10 hrs （粗制 DNA ）； 6．加入上样缓冲液终止酶切反应，也可 65 ℃加热 10 min 使酶变性失活； 7．电泳检测酶切效率： 每个样品取 1/10 量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。 结果分析： 若水稻 DNA 呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则需重做； DNA 被切烂： DNA 降解，重新提 DNA ； DNA 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化； 若是 BAC 克隆 DNA ，酶切后应出现多条很清晰的不同大小 DNA 带。 思考： 什么是酶星活性？如何避免？ 影响酶切效率的因素？ EB 指示剂原理？ 实验九 电泳、转膜 转膜是把 DNA 从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定， 是进行各种后续研究（如 RFLP 分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂 交的研究）的前提。 实验目的： 掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤 实验原理： 1．转膜的方式： 向上的毛细管转移 向下的毛细管转移