基因工程原理实验指导 同时向两张膜转移 申转移 真空转移 2.固相支持物的种类及选择： 硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA,<SO0bp的DNA无效 转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等） 尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的DNA结合容量，它能 够吸附变性DNA，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两 边均有吸附DNA的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用10次以 上(10-20次)，经毛细管（毛细吸附）作用，把DNA从凝胶上转到膜上。DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在80-100℃真空干燥2-4hs,即可固定DNA。 3.转移缓冲液(transfer buffer)的选择： 带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度(SSC),但不能充分发挥膜潜能：0.4N NaOH,共价结合DNA是最大优点 硝酸纤维膜：高盐离子强度促进DNA与膜结合(20×SSC),低盐离子强度 导致小片段DNA在转移过程中丢失，pH9,DNA不能与膜结合。 4.转膜时间(duration of transfer)约L2hrs 取决于毛细管系统，DNA大小，胶厚度(<5mm)及浓度(<I%)。 DNA分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小DNA,碱转移2hs大部分 结合到膜。 DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过EB染胶，及分子杂交才 可以鉴别效率高低，但己无补救措施，因此，每一步应严格操作。 实验材料及试剂：酶消化好的DNA样品，尼龙膜，O.2NHC, 0.4N NaOH 等 实验步骤： 1.0.8%琼脂糖电泳 制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度(<5mm)及均一性。一般大电泳槽 配制250ml0.8%琼脂糖凝胶，采用42孔梳子（经济，高效） 制样，点样：DNA样品中指示剂量稍多 电泳：一般1-l.5VICm的电压，使DNA迁移到适当距离，一般指示剂约移动 10-11cm(大电泳槽：40V×12-15hrs,小电泳槽30V×4-5hrs) 2.转膜前的准备： 依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸(11×12.5cm)，两张用作盐桥 的滤纸，一张与胶同样大小的尼龙膜(10×10.5cm）,两个玻璃盘、两块有机 玻璃板、一根玻璃棒，比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等。基因工程原理实验指导 17 同时向两张膜转移 电转移 真空转移 2．固相支持物的种类及选择： 硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失 DNA ， < 500 bp 的 DNA 无效， 转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等） 尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的 DNA 结合容量，它能 够吸附变性 DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两 边均有吸附 DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以 上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把 DNA 从凝胶上转到膜上。DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定 DNA 。 3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择： 带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合 DNA 是最大优点。 硝酸纤维膜：高盐离子强度促进 DNA 与膜结合（ 20 × SSC ），低盐离子强度 导致小片段 DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ， DNA 不能与膜结合。 4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs 取决于毛细管系统， DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。 DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小 DNA ，碱转移 2hrs 大部分 结合到膜。 DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才 可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。 实验材料及试剂： 酶消化好的 DNA 样品，尼龙膜， 0.2NHCl ， 0.4N NaOH 等 实验步骤： 1．0.8% 琼脂糖电泳 制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（<5mm）及均一性。一般大电泳槽 配制 250ml 0.8% 琼脂糖凝胶，采用 42 孔梳子（经济，高效） 制样，点样： DNA 样品中指示剂量稍多 电泳：一般 1-1.5V/cm 的电压，使 DNA 迁移到适当距离，一般指示剂约移动 10-11cm ( 大电泳槽： 40V × 12-15hrs ，小电泳槽 30V × 4-5 hrs) 2．转膜前的准备： 依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸（ 11 × 12.5 cm ），两张用作盐桥 的滤纸，一张与胶同样大小的尼龙膜（ 10 × 10.5cm ），两个玻璃盘、两块有机 玻璃板、一根玻璃棒，比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等