基因工程原理实验指导 3.一玻璃盘中加入足量的0.4 N NaOH,放上洗净的玻璃板，按图示搭制盐桥 (操作示范)。 4.凝胶的预处理： a从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角 (最后一个样品的最前端)作为电泳方向记号 b.把凝胶翻面，放入加有足量0.2NHCl的玻璃盘中，轻轻摇动10min,使指 示剂变黄色为止（脱嘌吟） c.倒去HCI溶液，加蒸馏水漂洗凝胶 d倒去蒸馏水，加0.4 N Naoh中和 e.同时在盐桥滤纸上洒些0.4NaOH,立即将胶放在盐桥上（忌气泡） 5.胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（吸水纸与盐桥相接） 6.在胶面上倒足够量0.4 N NaOH,小心放置膜（预湿0.4 N NaOH)使膜覆 盖整块胶（要求一次成功，不能移动） 7.膜上放2张滤纸，滤纸大小为15×12cm 8.放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约500g的重物，转膜12hrs 左右 9.转膜完毕，用2×SSC漂洗膜两次，各5min。用EB染胶以检测转移效 果。 10.用两张滤纸包住膜，置于80-100℃的真空干燥箱中，干燥2-4hs。 思考：(1)为什么转膜前要对凝胶预处理？如何处理？ (2)怎样提高转移效率？ 实验十RNA Extraction(mini prep) RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调节和cDNA的合成 都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot,.RT-PCR和cDNA文 库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因 素是尽量减少RNA酶的污染。 实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片 实验原理：SDS是一种去污剂，可以抑制内源RNA酶的活性，它不但可解聚 核酸与蛋白质的结合，还可与蛋白质带正电荷的侧链结合，形成SDS一蛋白质 复合物而沉淀。4 M LiCI可选择性沉淀RNA。 实验步骤： 1.Harvest fresh leaf discs in 2 ml eppendorf tubes and freeze quickly in liquid nitrogen and store at-80C until use. 2.Grind leaf discs using a steel bar (precooled in liquid nitrogen)that perfectly fits 18 基因工程原理实验指导 18 3．一玻璃盘中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗净的玻璃板，按图示搭制盐桥 ( 操作示范 ) 。 4．凝胶的预处理： a.从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角 （最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号 b.把凝胶翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盘中，轻轻摇动 10min ，使指 示剂变黄色为止（脱嘌呤） c.倒去 HCl 溶液，加蒸馏水漂洗凝胶 d.倒去蒸馏水，加 0.4N NaOH 中和 e.同时在盐桥滤纸上洒些 0.4 NaOH ，立即将胶放在盐桥上（忌气泡） 5．胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（吸水纸与盐桥相接） 6．在胶面上倒足够量 0.4N NaOH ，小心放置膜（预湿 0.4N NaOH ）使膜覆 盖整块胶（要求一次成功，不能移动） 7．膜上放 2 张滤纸，滤纸大小为 15 × 12cm 8．放不少于 5cm 厚的吸水纸，放上玻板，其上压约 500g 的重物，转膜 12 hrs 左右 9．转膜完毕，用 2 × SSC 漂洗膜两次，各 5min 。用 EB 染胶以检测转移效 果。 10．用两张滤纸包住膜，置于 80-100 ℃的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs 。 思考： （1）为什么转膜前要对凝胶预处理？如何处理？ （2）怎样提高转移效率？ 实验十 RNA Extraction (mini prep) RNA 的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调节和 cDNA 的合成 都是必须的， RNA 的纯度和完整性对于 Northern blot， RT-PCR 和 cDNA 文 库的构建等分子生物学实验都至关重要。 RNA 分离的方法很多，最关键的因 素是尽量减少 RNA 酶的污染。 实验目的：学习 RNA 的简易制备过程，通过 RNA 电泳带评价 RNA 质量 实验材料：水稻幼嫩叶片 实验原理：SDS 是一种去污剂，可以抑制内源 RNA 酶的活性，它不但可解聚 核酸与蛋白质的结合，还可与蛋白质带正电荷的侧链结合，形成 SDS －蛋白质 复合物而沉淀。 4 M LiCl 可选择性沉淀 RNA 。 实验步骤： 1、Harvest fresh leaf discs in 2 ml eppendorf tubes and freeze quickly in liquid nitrogen and store at -80℃ until use. 2、Grind leaf discs using a steel bar (precooled in liquid nitrogen) that perfectly fits