基因工程原理实验指导 下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与 核酸形成复合物，此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶，并稳定存在， 但在低盐浓度(0.1-0.5 nM NaCl)下CTAB·核酸复合物就因溶解度降低 而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB 核酸复合物再用70一75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊 醇(24：1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇 等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 实验步骤： 1.采集适量幼嫩叶片，用液N2研成粉末，0.4g装入1.5ml离心管中(-20℃ 预冷)。 2.预热1.5×CTAB到95℃，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防 止冻融)。 3.立即置于65℃水浴30min,每5min,上下颠倒1次。 4.12000g离心5min。 5.吸取上清液约600ul,加入等体积(600如l)氯仿/异戊醇(24：1)，上下 颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止 6.12000g离心5分钟. 7.取450ul上清于一新1.5ml离心管，加入1ml95%乙醇和45ul10M NH4AC,混匀，室温放置10min。 8.12000g离心10min,去上清，用75%Et0H浸洗沉淀，自然干燥约30min。 9.加入50ul1/10TE或无菌水（含20ug/RNase),置于4℃过夜，待DNA 溶解后，检测DNA浓度及质量。 注意事项： 1.尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的B-ME处理 2.研钵预冻，粉末至加CTAB前不要融化 3.24:1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的 4.所用试剂必需灭菌，手套 思考：(I)DNA降解的可能原因 (2)提高DNA产量的措施 实验八总DNA质量检测及酶切 实验目的：了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法：了解影响 DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素：训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作及 DNA的限制性内切酶操作。 实验原理：参见系列一中实验二：限制性内切酶的特点：见“基因操作原理”。基因工程原理实验指导 15 下， 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来 。 CTAB 与 核酸形成复合物，此复合物在高盐 （ >0.7mM ） 浓度下可溶，并稳定存在， 但在低盐浓度 （ 0.1-0.5mM NaCl ） 下 CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低 而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后， CTAB- 核酸复合物再用 70 － 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。 再经过氯仿 / 异戊 醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇 等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。 实验步骤： 1．采集适量幼嫩叶片，用液 N2 研成粉末，0.4 g 装入 1.5ml 离心管中（ -20 ℃ 预冷）。 2．预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃，加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防 止冻融）。 3．立即置于 65 ℃水浴 30min ，每 5 min，上下颠倒 1 次。 4．12000g 离心 5 min。 5．吸取上清液约 600µl ，加入等体积（ 600µl ）氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，上下 颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。 6．12000g 离心 5 分钟。 7．取 450µl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45µl 10M NH4AC ，混匀，室温放置 10min 。 8．12000 g 离心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。 9．加入 50µl 1/10 TE 或无菌水（含 20µg/RNase ），置于 4 ℃过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。 注意事项： 1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的 β -ME 处理 2．研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化 3．24:1 的氯仿 / 异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的 4．所用试剂必需灭菌，手套 思考：（1） DNA 降解的可能原因 （2）提高 DNA 产量的措施 实验八 总 DNA 质量检测及酶切 实验目的： 了解掌握检测 DNA 质量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影响 DNA 在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；训练 DNA 的琼脂糖凝胶电泳操作及 DNA 的限制性内切酶操作。 实验原理：参见系列一中实验二；限制性内切酶的特点：见“基因操作原理