6实验步骤 (1)每5人为一组，每人取5个02ml的PCR管，按顺序写上编号。 (2)配制RAPD扩增的反应液，各组份的用量及终浓度如下表： 如果是做多个反应，可将所用的相同组份一次取样、混合后再分装至各个反应中。 本实验中，每组用1种引物，每人做5种模板，每组共做25个反应。需另取1个0.5l 的PCR管配制混合液，然后分装到25个管中，每管分装量为22μL(由一位同学操作)。 注意：模板DNA不与其它组份混合，需预先加到5个管中。 组份 体积(1个反应) 终浓度 25个反应 ddH2O 经验值为16.6μL 10×buffer缓冲液（无Mg2*) 25uL 1× 25 nM MgCl2溶液 2.0μL 2mM 2 5mMdNTP 1.0uL 0.1mM 5M随机引物 1.0μL 0.2μM 模板DNA 3.0uL 约15ng/25μL Tag酶(3U/μL) 0.33μL IU25μL 总体积 25μL (3)RAPD扩增：配制好反应液后，放入PCR仪中进行扩增反应，扩增程序为：94℃5 (预变性)：94℃40”→38℃1'→72℃1'(40个循环)：72℃10'（延伸 反应)。 (4)制备1.5%的琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖、量取适量TBE电泳缓冲液，混合后 于微波炉中加热至溶化，补充蒸发的水分，制备得到浓度准确的琼脂糖凝胶， 适当冷却后小心倒胶，待凝胶板完全冷却后，小心拔去梳子，将胶板放入电泳 槽中，加电泳液淹没胶面。本实验中，需制作3块300ml的琼脂糖凝胶。 (5)电泳、染色及观察： 在每个反应产物中，加入适量的载样缓冲液，混合均匀，得到混合物： 于每个梳孔中，点加适量的混合物(20μL),每排梳孔中最左边的梳孔用于点 加DNA Marker(分子量标记物)，以便计算分子量： 以2~3Vcm的电压进行衡压电泳，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳： 将胶块没入EB染液中染色1~2h,用自来水冲洗后于凝胶成像系统上扫描成像 99 6 实验步骤 （1） 每 5 人为一组，每人取 5 个 0.2ml 的 PCR 管，按顺序写上编号。 （2） 配制 RAPD 扩增的反应液，各组份的用量及终浓度如下表： 如果是做多个反应，可将所用的相同组份一次取样、混合后再分装至各个反应中。 本实验中，每组用 1 种引物，每人做 5 种模板，每组共做 25 个反应。需另取 1 个 0.5ml 的 PCR 管配制混合液，然后分装到 25 个管中，每管分装量为 22μL（由一位同学操作）。 注意：模板 DNA 不与其它组份混合，需预先加到 5 个管中。 组份 体积（1 个反应） 终浓度 25 个反应 ddH2O 经验值为 16.6μL 10×buffer 缓冲液（无 Mg2+） 2.5μL 1× 25mM MgCl2 溶液 2.0μL 2mM 2.5mM dNTP 1.0μL 0.1mM 5μM 随机引物 1.0μL 0.2μM 模板 DNA 3.0μL 约 15ng/25μL Taq 酶（3U/μL） 0.33μL 1U/25μL 总体积 25μL （3） RAPD 扩增：配制好反应液后，放入 PCR 仪中进行扩增反应，扩增程序为：94℃ 5′ （预变性）；94℃ 40″→38℃ 1′→72℃ 1′（40 个循环）；72℃ 10′（延伸 反应）。 （4） 制备 1.5％的琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖、量取适量 TBE 电泳缓冲液，混合后 于微波炉中加热至溶化，补充蒸发的水分，制备得到浓度准确的琼脂糖凝胶， 适当冷却后小心倒胶，待凝胶板完全冷却后，小心拔去梳子，将胶板放入电泳 槽中，加电泳液淹没胶面。本实验中，需制作 3 块 300ml 的琼脂糖凝胶。 （5） 电泳、染色及观察： 在每个反应产物中，加入适量的载样缓冲液，混合均匀，得到混合物； 于每个梳孔中，点加适量的混合物（20μL），每排梳孔中最左边的梳孔用于点 加 DNA Marker（分子量标记物），以便计算分子量； 以 2～3V/cm 的电压进行衡压电泳，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳； 将胶块没入 EB 染液中染色 1～2h，用自来水冲洗后于凝胶成像系统上扫描成像