《园艺植物育种学》 设计性实验指导书 胡桂兵刘成明编 华南农业大学 园艺学院果树学系 2003年10月
《园艺植物育种学》 设计性实验指导书 胡桂兵 刘成明编 华南农业大学 园艺学院果树学系 2003 年 10 月
《园艺植物育种学》 设计性实验指导 实验名称：园艺植物基因组DNA的提取及RAPD分析 隶属课程：《园艺植物育种学》 课程类别：必修课 预计学时：6学时 指导教师：胡桂兵副教授、刘成明教授、胡志群实验师 授课对象：园艺专业本科生 1
1 《园艺植物育种学》 设计性实验指导 实验名称：园艺植物基因组 DNA 的提取及 RAPD 分析 隶属课程：《园艺植物育种学》 课程类别：必修课 预计学时：6 学时 指导教师：胡桂兵副教授、刘成明教授、胡志群实验师 授课对象：园艺专业本科生
实验一园艺植物基因组DNA的提取及浓度测定 1目的 掌握用改良SDS法提取园艺植物总DNA的原理和方法，并分别用核 酸蛋白测定仪和凝胶电泳法检测出所提DNA的质量。 2原理 2.1DM提取：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基疏酸 钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)这个离子型表面活性剂，溶解细胞 膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核 中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物）：再加入苯酚和氯仿等表面活性剂， 使蛋白变性：经离心除去果树的组织和变性蛋白：上清液中加入无水乙醇 使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得园艺植物总DNA溶液。 2.2分光光度（紫外吸收）法检测DNA质量：DNA的吸收峰在260nm, 对于双链DNA,OD26o=1.0时溶液浓度为50μgml,这样通过用紫外分光 光度计测定所提DNA溶液在26Onm的吸光值，可以计算出所提DNA的浓 度，计算公式为：DNA样品浓度（μg/μI)=OD26o×N(样品稀释倍数） ×50/1000。而蛋白质的吸收峰在280nm,核苷酸等小分子量物质的吸收峰 在230m,这样通过测定OD280和OD230的吸光值，计算出OD26o/OD20及 OD260/OD20的比值后，可以判断所提DNA的纯度：纯的DNA溶液其OD260 OD280及应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。OD26/OD280大于1.9时，表明 有RNA污染；小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD230小于2.0时
2 实验一 园艺植物基因组 DNA 的提取及浓度测定 1 目的 掌握用改良 SDS 法提取园艺植物总 DNA 的原理和方法，并分别用核 酸蛋白测定仪和凝胶电泳法检测出所提 DNA 的质量。 2 原理 2.1 DNA 提取：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基硫酸 钠（sodium dodecyl sulfate，简称 SDS）这个离子型表面活性剂，溶解细胞 膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核 中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物）；再加入苯酚和氯仿等表面活性剂， 使蛋白变性；经离心除去果树的组织和变性蛋白；上清液中加入无水乙醇 使 DNA 沉淀；沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中，即得园艺植物总 DNA 溶液。 2.2 分光光度（紫外吸收）法检测 DNA 质量：DNA 的吸收峰在 260nm， 对于双链 DNA，OD260=1.0 时溶液浓度为 50μg/ml，这样通过用紫外分光 光度计测定所提 DNA 溶液在 260nm 的吸光值，可以计算出所提 DNA 的浓 度，计算公式为：DNA 样品浓度（μg/μl）= OD260×N（样品稀释倍数） ×50/1000。而蛋白质的吸收峰在 280nm，核苷酸等小分子量物质的吸收峰 在 230nm，这样通过测定 OD280和 OD230的吸光值，计算出 OD260/ OD280及 OD260/ OD230的比值后，可以判断所提DNA的纯度：纯的DNA 溶液其OD260/ OD280及应为 1.8，OD260/ OD230应大于 2.0。OD260/ OD280大于 1.9 时，表明 有 RNA 污染；小于 1.6 时表明有蛋白质或酚污染。OD260/ OD230小于 2.0 时
表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 2.3琼脂糖凝胶电泳检测DNM质量：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子， 沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同DNA, 其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量 的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发 射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游 离状态EB发射的荧光强度大I0倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。 用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。 3实验材料 每个学生做1个老师已经准备的幼嫩、健康的园艺植物叶片。 4仪器设备 高速冷冻离心机(Ependorf Centrifuge5810R)、高速台式离心机 (Ependorf Centrifuge5415D)、入电泳装置（包括BIO-RAD Sub-Cell192电 泳槽和PAC300电泳仪)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、Biophotometer核酸 蛋白测定仪、MicroBio Mixer Genius、液氮罐、振荡器、电子天平、恒温水 浴锅、烘箱、微波炉等
3 表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子， 沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同 DNA， 其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量 的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发 射荧光。EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其发射的荧光强度较游 离状态 EB 发射的荧光强度大 10 倍以上，且荧光强度与 DNA 含量成正比。 用肉眼观察，可检测到 5ng 以上的 DNA。 3 实验材料 每个学生做 1 个老师已经准备的幼嫩、健康的园艺植物叶片。 4 仪器设备 高速冷冻离心机（Ependorf Centrifuge 5810R）、高速台式离心机 （Ependorf Centrifuge 5415D）、电泳装置（包括 BIO-RAD Sub-Cell 192 电 泳槽和 PAC300 电泳仪）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、Biophotometer 核酸 蛋白测定仪、MicroBio Mixer Genius、液氮罐、振荡器、电子天平、恒温水 浴锅、烘箱、微波炉等
5实验用具 50ml离心管(3只/个材料)、1.5ml离心管(3只/个材料)、研钵（每 人1套)、小剪刀、棉纱手套、不锈钢药匙、10ml移液管、50ml离心管架、 1.5ml离心管盒、吸耳球、1ml移液枪、1ml吸头、1ml吸头盒、100μ1移 液枪、200μ1吸头、200μ1吸头盒、10μ1移液枪、10μ1吸头、10μ1吸 头盒、冰盒、各种规格的试剂瓶若干个。 6试剂 液氮、改良SDS提取液【1.5%SDS(WV),100 mMTris-HCI(pH8.O), 20 nMEDTA(pH8.0),500 nMNaCl,3.0%PVP(WW),0.2%B-巯基乙醇 (VV)小、氯仿-异戊醇(24：1)无水乙醇、70%乙醇、TE、RNA酶(10mg/ml)、 琼脂糖、TAE、5 MNaCl、DNA分子量标记、EB溶液(O.5μgml) 7实验步骤 (1)、在电子天平上称取1.0克用小剪刀剪去主脉的幼嫩叶片，于液态N2 中研磨成粉末。 (2)、用不锈钢药匙把粉末立即转入50ml离心管中，加入15ml经65℃预 热的改良SDS提取液，于65℃水浴锅中裂解60min,其间轻摇数次。 (3)、加入l5ml氯仿-异戊醇，用MicroBio Mixer Genius或双手上下颠倒 震荡10min(第一次去蛋白)。 (4)、4000rpm,离心10min。 (5)、用1ml移液枪转上清液于新的50ml离心管中
4 5 实验用具 50ml 离心管（3 只/个材料）、1.5ml 离心管（3 只/个材料）、研钵（每 人 1 套）、小剪刀、棉纱手套、不锈钢药匙、10ml 移液管、50ml 离心管架、 1.5ml 离心管盒、吸耳球、1ml 移液枪、1ml 吸头、1ml 吸头盒、100μl 移 液枪、200μl 吸头、200μl 吸头盒、10μl 移液枪、10μl 吸头、10μl 吸 头盒、冰盒、各种规格的试剂瓶若干个。 6 试剂 液氮、改良 SDS 提取液【1.5%SDS(W/V)，100mMTris-HCl(pH8.0)， 20mMEDTA(pH8.0)，500mMNaCl，3.0%PVP(W/V)，0.2%β-巯基乙醇 (V/V)】、氯仿-异戊醇（24：1）、无水乙醇、70％乙醇、TE、RNA 酶（10mg/ml）、 琼脂糖、TAE、5M NaCl、DNA 分子量标记、EB 溶液（0.5μg/ml） 7 实验步骤 （1）、在电子天平上称取 1.0 克用小剪刀剪去主脉的幼嫩叶片，于液态 N2 中研磨成粉末。 （2）、用不锈钢药匙把粉末立即转入 50ml 离心管中，加入 15ml 经 65℃预 热的改良 SDS 提取液，于 65℃水浴锅中裂解 60min，其间轻摇数次。 （3）、加入 15ml 氯仿-异戊醇，用 MicroBio Mixer Genius 或双手上下颠倒 震荡 10min（第一次去蛋白）。 （4）、4000rpm，离心 10min。 （5）、用 1ml 移液枪转上清液于新的 50ml 离心管中
(6)、用10ml移液管加15ml氯仿-异戊醇，用MicroBio Mixer Genius或双 手上下颠倒震荡l0min(第二次去蛋白)。 (7)、4000rpm离心10mim,用1ml移液枪转上清液于新的50ml离心管中， 加等体积的冷乙醇沉淀DNA。 (8)、用枪头或灭菌的牙签挑出DNA絮团于新的1.5ml离心管中（如无法 挑出，则离心沉淀DNA),用0%乙醇漂洗二次后，吸去液相，于 培养箱或超净台上风干。 (9)、加0.5ml含RNA酶（终浓度为10μg/ml)的TE,于50~58℃水浴 锅中保温消解RNA【上午做到此步，下午2：00接着做下面的步骤】 (10)、12000rpm,离心10min。 (11)、转上清液于1.5ml离心管，按上清液体积加入14体积的5 M NaCI, 混匀，4℃下放置60min(盐析去多糖)。 (12)、12000pm离心10mn,转上清液于新的1.5ml离心管中，加2倍体 积的冷乙醇沉淀DNA,离心，用70%乙醇漂洗后，吸去液相，培养 箱或超净台上风干。 (13)、加0.5mlTE(根据所得的DNA的量来决定，如果量少则0.1~02ml) 溶解DNA,12000pm离心除去不溶物。 (14入Biophotometer核酸蛋白测定仪分析：取15μ1DNA样品稀释 20倍，在Biophotometer核酸蛋白测定仪上测定A260、A280和A230值， 记录所测结果，判定所提DNA的浓度和纯度。 (15)、琼脂糖凝胶电泳分析：用0.8%的凝胶【老师已经做好】，点4μ1 所提的样品，电泳检测精制DNA质量，估算出浓度
5 （6）、用 10ml 移液管加 15ml 氯仿-异戊醇，用 MicroBio Mixer Genius 或双 手上下颠倒震荡 10min（第二次去蛋白）。 （7）、4000rpm 离心 10min，用 1ml 移液枪转上清液于新的 50ml 离心管中， 加等体积的冷乙醇沉淀 DNA。 （8）、用枪头或灭菌的牙签挑出 DNA 絮团于新的 1.5ml 离心管中（如无法 挑出，则离心沉淀 DNA），用 70%乙醇漂洗二次后，吸去液相，于 培养箱或超净台上风干。 （9）、加 0.5ml 含 RNA 酶（终浓度为 10μg/ml）的 TE，于 50～58℃水浴 锅中保温消解 RNA【上午做到此步，下午 2：00 接着做下面的步骤】。 （10）、12000rpm，离心 10min。 （11）、转上清液于 1.5ml 离心管，按上清液体积加入 1/4 体积的 5M NaCl， 混匀，4℃下放置 60min（盐析去多糖）。 （12）、12000rpm 离心 10min，转上清液于新的 1.5ml 离心管中，加 2 倍体 积的冷乙醇沉淀 DNA，离心，用 70%乙醇漂洗后，吸去液相，培养 箱或超净台上风干。 （13）、加 0.5mlTE（根据所得的 DNA 的量来决定，如果量少则 0.1~0.2ml） 溶解 DNA，12000rpm 离心除去不溶物。 （14）、Biophotometer 核酸蛋白测定仪分析：取 15μl DNA 样品稀释 20 倍，在 Biophotometer 核酸蛋白测定仪上测定 A260、A280 和 A230 值， 记录所测结果，判定所提 DNA 的浓度和纯度。 （15）、琼脂糖凝胶电泳分析：用 0.8％的凝胶【老师已经做好】，点 4μl 所提的样品，电泳检测精制 DNA 质量，估算出浓度
(16)、把所提DNA溶液，稀释至5ngμ1的浓度，4℃下保存备用。 8具体做法 全组分成5个小组，8人一组，每人选择一种园艺植物按照实验步骤提 取基因组DNA。 9实验报告 每人写一份，按学术论文格式参考老师提供的范文撰写，包括：题目、 作者、正文（前言、材料和方法、结果与分析、讨论、参考文献）等，其 中结果中要附上自己所提样品的电泳图
6 （16）、把所提 DNA 溶液，稀释至 5ng/μl 的浓度， 4℃下保存备用。 8 具体做法 全组分成 5 个小组，8 人一组，每人选择一种园艺植物按照实验步骤提 取基因组 DNA。 9 实验报告 每人写一份，按学术论文格式参考老师提供的范文撰写，包括：题目、 作者、正文（前言、材料和方法、结果与分析、讨论、参考文献）等，其 中结果中要附上自己所提样品的电泳图
实验2RAPD分析的原理及操作技术 1目的 分子标记是一类建立在分子水平上的遗传标记，它同样具有遗传标记的两个特点， 即可遗传性和可识别性。广义的分子标记包括同工酶和DNA分子标记两类，狭义的分 子标记则仅指后者。DNA分子标记通常是一些小分子量的DNA片段（几十到2O0Obp), 大量存在于真核生物的基因组内，能够通过特定的技术和方法进行检测。一般而言，分 子标记并不是基因，也不是基因的一个部分，但它往往与目的基因（目的性状）有连锁 关系。利用这种连锁关系（越紧密越好），可以对目的基因进行识别和分离，对目的性 状进行早期预选，对优良基因进行聚合育种，从而大大促进园艺植物的育种工作。DNA 分子标记的种类很多，常用的有RAPD(随机扩增多态性DNA)、RFLP(限制性片段长 度多态性)、AFLP(扩增片段长度多态性)、SSR(简单序列重复)等，本实验主要介绍 RAPD分析的实验方法，以了解园艺植物分子标记的基本原理，认识和掌握RAPD分析 在园艺育种中的应用及实验操作技术。 2原理 虽然DNA的基本单元是一个个的单核苷酸，但在只有模板和单核苷酸(NTP)的 反应体系中，DNA聚合酶(Tg酶)并不能启动扩增反应，这是因为该酶催化的反应是 一种延伸反应（在已有的DNA链的3'-OH端掺入单核苷酸，形成磷酸二酯键，合成方 向为5'一3)，因此，还需要在反应体系中提供特定的DNA短链（称为引物），用以启 动DNA的聚合反应。 常规的PCR扩增过程为：①将反应体系（模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4 种dNTP和Tag DNA聚合酶，引物1和2都是特异合成的长度为15一30核苷酸的单链 DNA)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链；②在低温(40 一60℃)下退火，使引物与模板链3端互补区结合形成部分双链DNA:③在中温(72℃》 下延伸，Tag DNA聚合酶根据模板的核苷酸顺序，将单核苷酸从引物的3'端顺次掺入， 催化磷酸二酯键生成，实现新链的延伸。如此变性、退火、延伸，三步构成的一个循环， 可使两种引物限定范围内的DNA序列扩增一倍。由于每次循环的产物都能成为下一循 环的模板，因而PC产物量以指数方式增加，从理论上计算，经过20个循环，目的 7
7 实验 2 RAPD 分析的原理及操作技术 1 目的 分子标记是一类建立在分子水平上的遗传标记，它同样具有遗传标记的两个特点， 即可遗传性和可识别性。广义的分子标记包括同工酶和 DNA 分子标记两类，狭义的分 子标记则仅指后者。DNA 分子标记通常是一些小分子量的 DNA 片段（几十到 2000bp）， 大量存在于真核生物的基因组内，能够通过特定的技术和方法进行检测。一般而言，分 子标记并不是基因，也不是基因的一个部分，但它往往与目的基因（目的性状）有连锁 关系。利用这种连锁关系（越紧密越好），可以对目的基因进行识别和分离，对目的性 状进行早期预选，对优良基因进行聚合育种，从而大大促进园艺植物的育种工作。DNA 分子标记的种类很多，常用的有 RAPD（随机扩增多态性 DNA）、RFLP（限制性片段长 度多态性）、AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单序列重复）等，本实验主要介绍 RAPD 分析的实验方法，以了解园艺植物分子标记的基本原理，认识和掌握 RAPD 分析 在园艺育种中的应用及实验操作技术。 2 原理 虽然 DNA 的基本单元是一个个的单核苷酸，但在只有模板和单核苷酸（dNTP）的 反应体系中，DNA 聚合酶（Taq 酶）并不能启动扩增反应，这是因为该酶催化的反应是 一种延伸反应（在已有的 DNA 链的 3’-OH 端掺入单核苷酸，形成磷酸二酯键，合成方 向为 5’→3’），因此，还需要在反应体系中提供特定的 DNA 短链（称为引物），用以启 动 DNA 的聚合反应。 常规的 PCR 扩增过程为：① 将反应体系（模板 DNA、引物 1、引物 2、Mg2+、4 种 dNTP 和 Taq DNA 聚合酶，引物 1 和 2 都是特异合成的长度为 15－30 核苷酸的单链 DNA）置于高温（94℃）下变性，使模板双链 DNA 解链为两条单链；② 在低温（40 －60℃）下退火，使引物与模板链 3’端互补区结合形成部分双链 DNA；③ 在中温（72℃） 下延伸，Taq DNA 聚合酶根据模板的核苷酸顺序，将单核苷酸从引物的 3’端顺次掺入， 催化磷酸二酯键生成，实现新链的延伸。如此变性、退火、延伸，三步构成的一个循环， 可使两种引物限定范围内的 DNA 序列扩增一倍。由于每次循环的产物都能成为下一循 环的模板，因而 PCR 产物量以指数方式增加，从理论上计算，经过 20 个循环，目的
DNA可被扩增10。 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)是一种建立在PCR技术基础上、可 对整个基因组进行选择性扩增的分子标记技术。它是以一个随机合成的10寡核苷酸为 引物，在未知序列的基因组DNA上，对部分DNA序列进行随机扩增，产生长度不同 的DNA产物，通过电泳分离和EB(溴化乙锭，剧毒药品)染色，显示出扩增的DNA 条带。一般来讲，只有当模板DNA链上不太长（≤200Obp)的区域内，存在2个与随 机引物反向互补（基本或完全互补）的序列，这一段DNA片段才能被扩增，其数量也 是以指数方式递增。RAPD与常规PCR的不同之处是：①所用的引物比较短，为随机 合成的10寡核苷酸单链：②扩增反应中只用一个引物，但实际起到两个引物的作用： ③扩增循环中所用的退火温度较低(35一40℃)，以利于多态性的检出。 由于DNA聚合酶(Tag酶)的聚合能力和琼脂糖凝胶的分辨能力的限制，RAPD片 段的最佳长度一般为400~2000bp。 3实验材料 通过实验一制备得到的质量合格、浓度准确的植物基因组DNA溶液 4主要仪器设备（下划线示必须设备）和实验用具 PCR扩增仪Pekin Elmer公司)，高速冷冻离心机(Beckman公司)，低温高速离心机 (Eppendorf公司)，DU-640紫外分光光度计(Beckman公司)，电泳系统BIO-RAD 公司，凝胶成象系统BIO-RAD公司)。移液枪，灭菌的PCR管、离心管、吸头等。 5主要试剂 灭菌的ddHO:I0×buffer缓冲液（不含MgCb):25 nM M.Clz溶液：dNTP(每种 2.5mM): 随机引物经准确定量后，取少量用ddH20稀释成5M溶液，-20℃下保存备用： 模板DNA经准确定量后，取少量用ddHO稀释成5gL溶液，4℃下保存备用： Tag酶液(3U/μL):TBE电泳缓冲液：载样缓冲液(6×或10×)： 琼脂糖(BIOWEST):EB染液
8 DNA 可被扩增 106。 RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）是一种建立在 PCR 技术基础上、可 对整个基因组进行选择性扩增的分子标记技术。它是以一个随机合成的 10 寡核苷酸为 引物，在未知序列的基因组 DNA 上，对部分 DNA 序列进行随机扩增，产生长度不同 的 DNA 产物，通过电泳分离和 EB（溴化乙锭，剧毒药品）染色，显示出扩增的 DNA 条带。一般来讲，只有当模板 DNA 链上不太长（≤2000bp）的区域内，存在 2 个与随 机引物反向互补（基本或完全互补）的序列，这一段 DNA 片段才能被扩增，其数量也 是以指数方式递增。RAPD 与常规 PCR 的不同之处是：① 所用的引物比较短，为随机 合成的 10 寡核苷酸单链；② 扩增反应中只用一个引物，但实际起到两个引物的作用； ③ 扩增循环中所用的退火温度较低（35－40℃），以利于多态性的检出。 由于 DNA 聚合酶（Taq 酶）的聚合能力和琼脂糖凝胶的分辨能力的限制，RAPD 片 段的最佳长度一般为 400～2000bp。 3 实验材料 通过实验一制备得到的质量合格、浓度准确的植物基因组 DNA 溶液。 4 主要仪器设备（下划线示必须设备）和实验用具 PCR 扩增仪(Pekin Elmer 公司)，高速冷冻离心机(Beckman 公司)，低温高速离心机 （Eppendorf 公司），DU-640 紫外分光光度计(Beckman 公司)，电泳系统(BIO-RAD 公司)，凝胶成象系统(BIO-RAD 公司)。移液枪，灭菌的 PCR 管、离心管、吸头等。 5 主要试剂 灭菌的 ddH2O；10×buffer 缓冲液（不含 MgCl2）；25mM MgCl2 溶液；dNTP（每种 2.5mM）； 随机引物经准确定量后，取少量用 ddH2O 稀释成 5µM 溶液，-20℃下保存备用； 模板 DNA 经准确定量后，取少量用 ddH2O 稀释成 5ng/µL 溶液，4℃下保存备用； Taq 酶液（3U/μL）；TBE 电泳缓冲液；载样缓冲液（6×或 10×）； 琼脂糖（BIOWEST）；EB 染液
6实验步骤 (1)每5人为一组，每人取5个02ml的PCR管，按顺序写上编号。 (2)配制RAPD扩增的反应液，各组份的用量及终浓度如下表： 如果是做多个反应，可将所用的相同组份一次取样、混合后再分装至各个反应中。 本实验中，每组用1种引物，每人做5种模板，每组共做25个反应。需另取1个0.5l 的PCR管配制混合液，然后分装到25个管中，每管分装量为22μL(由一位同学操作)。 注意：模板DNA不与其它组份混合，需预先加到5个管中。 组份 体积(1个反应) 终浓度 25个反应 ddH2O 经验值为16.6μL 10×buffer缓冲液（无Mg2*) 25uL 1× 25 nM MgCl2溶液 2.0μL 2mM 2 5mMdNTP 1.0uL 0.1mM 5M随机引物 1.0μL 0.2μM 模板DNA 3.0uL 约15ng/25μL Tag酶(3U/μL) 0.33μL IU25μL 总体积 25μL (3)RAPD扩增：配制好反应液后，放入PCR仪中进行扩增反应，扩增程序为：94℃5 (预变性)：94℃40”→38℃1'→72℃1'(40个循环)：72℃10'（延伸 反应)。 (4)制备1.5%的琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖、量取适量TBE电泳缓冲液，混合后 于微波炉中加热至溶化，补充蒸发的水分，制备得到浓度准确的琼脂糖凝胶， 适当冷却后小心倒胶，待凝胶板完全冷却后，小心拔去梳子，将胶板放入电泳 槽中，加电泳液淹没胶面。本实验中，需制作3块300ml的琼脂糖凝胶。 (5)电泳、染色及观察： 在每个反应产物中，加入适量的载样缓冲液，混合均匀，得到混合物： 于每个梳孔中，点加适量的混合物(20μL),每排梳孔中最左边的梳孔用于点 加DNA Marker(分子量标记物)，以便计算分子量： 以2~3Vcm的电压进行衡压电泳，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳： 将胶块没入EB染液中染色1~2h,用自来水冲洗后于凝胶成像系统上扫描成像 9
9 6 实验步骤 （1） 每 5 人为一组，每人取 5 个 0.2ml 的 PCR 管，按顺序写上编号。 （2） 配制 RAPD 扩增的反应液，各组份的用量及终浓度如下表： 如果是做多个反应，可将所用的相同组份一次取样、混合后再分装至各个反应中。 本实验中，每组用 1 种引物，每人做 5 种模板，每组共做 25 个反应。需另取 1 个 0.5ml 的 PCR 管配制混合液，然后分装到 25 个管中，每管分装量为 22μL（由一位同学操作）。 注意：模板 DNA 不与其它组份混合，需预先加到 5 个管中。 组份 体积（1 个反应） 终浓度 25 个反应 ddH2O 经验值为 16.6μL 10×buffer 缓冲液（无 Mg2+） 2.5μL 1× 25mM MgCl2 溶液 2.0μL 2mM 2.5mM dNTP 1.0μL 0.1mM 5μM 随机引物 1.0μL 0.2μM 模板 DNA 3.0μL 约 15ng/25μL Taq 酶（3U/μL） 0.33μL 1U/25μL 总体积 25μL （3） RAPD 扩增：配制好反应液后，放入 PCR 仪中进行扩增反应，扩增程序为：94℃ 5′ （预变性）；94℃ 40″→38℃ 1′→72℃ 1′（40 个循环）；72℃ 10′（延伸 反应）。 （4） 制备 1.5％的琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖、量取适量 TBE 电泳缓冲液，混合后 于微波炉中加热至溶化，补充蒸发的水分，制备得到浓度准确的琼脂糖凝胶， 适当冷却后小心倒胶，待凝胶板完全冷却后，小心拔去梳子，将胶板放入电泳 槽中，加电泳液淹没胶面。本实验中，需制作 3 块 300ml 的琼脂糖凝胶。 （5） 电泳、染色及观察： 在每个反应产物中，加入适量的载样缓冲液，混合均匀，得到混合物； 于每个梳孔中，点加适量的混合物（20μL），每排梳孔中最左边的梳孔用于点 加 DNA Marker（分子量标记物），以便计算分子量； 以 2～3V/cm 的电压进行衡压电泳，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳； 将胶块没入 EB 染液中染色 1～2h，用自来水冲洗后于凝胶成像系统上扫描成像