园艺植物病害防治药剂筛选实验指导 (综合性实验) 本实验包括室内测定不同药剂对离体植物病原菌的毒力和田间比较不同农药的防病效 果。要求学生深入生产实际调杏，东分了解民艺作物生产中的灾害发生情况，拟定防治目标 通过实验筛选出有效的防治药剂。 历时30-50升 ,全过程如下 1、通过调查选定生产中某种常见的病害作为防治目标。 2、从发病的植株上分离这种病害的病原物，并进行纯化培养。 3、进行室内药剂毒力测定，选出几种对离体病原菌有明显抑制作用的药剂。 4、在田间栽培供试作物，人工诱发病吉，同时进行药剂防治处理 5、对不同 剂处理的 区进行发病严重程度的调查 6、对实验数据进行统计分析，筛选出有效的防病药剂，写出实验报告。 通过该项实验可激发学生对本专业课程的学习兴趣，了解园艺作物生产实际中的病虫害 发生情况，更好地理解植物病害发生和防治的理论，掌捉筛选植物病害防治药剂的方法。 培养基的配制及培养皿的灭菌 1.马铃薯葡萄糖（或糖）琼脂培养基：是培养真最常用的培养基 成分如下：去皮马铃薯 200 克 葡萄糖（或蔗糖）20 脂 17-20克 1000升 配置方法 将马铃薯洗净去皮 称取200克 ,切成小块，放入锅中加水1000毫升，煮 沸半小时，然后用双层洁净纱布过滤去渣，在滤液中加葡萄糖（或蔗糖）20克，加水补足 1000毫升。配成的培养液一般呈酸性，若用于培养真菌，可以不必矫正它的酸度。如配成 固体培养基，可加入琼脂17一20克，加热使琼脂完全融化，同时补足应有的水量。趁热分 装在试管或三角瓶中，加棉花塞后灭菌。每管约5熹升 2。牛肉浸青蛋白陈培养基：是培养细菌最常用的培养基 成分如下：牛肉浸青 蛋白胨 5一10克 葡萄糖或蔗糖 10 琼脂 17-20克 1000毫升 配置方法：先将牛肉浸膏、蛋白胨和糖溶于少量热水中，然后加水到1000毫升，矫正 其酸度到中性反应，加入琼脂溶化，趁热装入试管或三角瓶，加棉花塞后灭菌。 娇正培养基酸度的方法： 用刻度吸管吸取5毫升培养液于试管中，加入麝香兰指示剂5滴。如培养基呈黄色（表 示酸性)，则用有刻度的吸管加入NW20的NaOH调节：若培养基呈兰色（表示碱性），则加 NW20的HC 调节。最后，使培养基呈草绿色为止 记下所加NW20的NaOH或HC的量 以加入的量乘10，即为1000毫升培养基中应加1 N NaOH或HC1的量。例如5毫升的培养 基加N/20NaOH0.3毫升既达到中性反应，则在1000毫升培养基中应加入1 N NaOH3毫升。 3.培养基的灭菌 1
1 园艺植物病害防治药剂筛选实验指导 （综合性实验） 本实验包括室内测定不同药剂对离体植物病原菌的毒力和田间比较不同农药的防病效 果。要求学生深入生产实际调查，充分了解园艺作物生产中的病害发生情况，拟定防治目标， 通过实验筛选出有效的防治药剂。 实验历时 30-50 天，全过程如下： 1、通过调查选定生产中某种常见的病害作为防治目标。 2、从发病的植株上分离这种病害的病原物，并进行纯化培养。 3、进行室内药剂毒力测定，选出几种对离体病原菌有明显抑制作用的药剂。 4、在田间栽培供试作物，人工诱发病害，同时进行药剂防治处理。 5、对不同药剂处理的小区进行发病严重程度的调查。 6、对实验数据进行统计分析，筛选出有效的防病药剂，写出实验报告。 通过该项实验可激发学生对本专业课程的学习兴趣，了解园艺作物生产实际中的病虫害 发生情况，更好地理解植物病害发生和防治的理论，掌握筛选植物病害防治药剂的方法。 一、 培养基的配制及培养皿的灭菌 1. 马铃薯葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基：是培养真菌最常用的培养基 成分如下：去皮马铃薯 200 克 葡萄糖（或蔗糖） 20 克 琼 脂 17—20 克 水 1000 毫升 配置方法：将马铃薯洗净去皮，称取 200 克，切成小块，放入锅中加水 1000 毫升，煮 沸半小时，然后用双层洁净纱布过滤去渣，在滤液中加葡萄糖（或蔗糖）20 克，加水补足 1000 毫升。配成的培养液一般呈酸性，若用于培养真菌，可以不必矫正它的酸度。如配成 固体培养基，可加入琼脂 17—20 克，加热使琼脂完全融化，同时补足应有的水量。趁热分 装在试管或三角瓶中，加棉花塞后灭菌。每管约 5 毫升。 2. 牛肉浸膏蛋白胨培养基：是培养细菌最常用的培养基 成分如下：牛肉浸膏 3 克 蛋白胨 5—10 克 葡萄糖或蔗糖 10 克 琼 脂 17—20 克 水 1000 毫升 配置方法：先将牛肉浸膏、蛋白胨和糖溶于少量热水中，然后加水到 1000 毫升，矫正 其酸度到中性反应，加入琼脂溶化，趁热装入试管或三角瓶，加棉花塞后灭菌。 矫正培养基酸度的方法： 用刻度吸管吸取 5 毫升培养液于试管中，加入麝香兰指示剂 5 滴。如培养基呈黄色（表 示酸性），则用有刻度的吸管加入 N/20 的 NaOH 调节；若培养基呈兰色（表示碱性），则加 N/20 的 HCl 调节。最后，使培养基呈草绿色为止，记下所加 N/20 的 NaOH 或 HCl 的量， 以加入的量乘 10，即为 1000 毫升培养基中应加 1N NaOH 或 HCl 的量。例如 5 毫升的培养 基加N/20 NaOH 0.3毫升既达到中性反应，则在1000毫升培养基中应加入1N NaOH 3 毫升。 3. 培养基的灭菌
配制好的培养基必须经过灭菌后方能使用，培养基的灭菌一般是用高压蒸汽灭菌法（又 称湿热灭茵)。其原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。将要灭菌的培 养基、灭菌水等置于灭菌锅中， 一般锅中加入 4000毫升（不同的高压灭菌锅加水的 量不同)，密闭锅盖，打开排气活门，加热至锅内空气全部排除（可根据活门冲击的全部是 燕汽时来确定排气是否彻底)，即可关闭排气活门。锅内压力逐渐提高。当压力表指针达到 每平方时为15磅压力时（即1.1公斤/平方厘米，蒸汽温度相当于121℃）时，开始计算灭 均时间，一般液体培养基保持20一30分钟：固体培养基保持40一60分钟，然后停止加温。 略微打开排气活门 使蒸汽慢慢排出来 蒸汽全部 出后，即可打开锅盖，将培养基等取 出冷却。如需用固体斜面培养基，则将试管斜放在桌上冷却既成。 4.灭菌水的配制 量取10毫升的蒸馏水（或自来水）置试管中，加棉花塞后灭菌。 5,玻璃器皿的灭菌 培养用的玻璃器皿通常采用干热灭菌。方法是将需灭菌的器皿洗净擦干，用纸包好，或 放在金属盒内，置于干热灭菌箱（电烘箱）中，加温至165一175℃ 保持 小时后，即可 停加温。待温度逐渐下降到40℃以下，才能打开温箱取用，避免由于高温骤然下降而引起 玻璃器皿破裂。 二、 病原真菌和细菌的分离 分离就是用人工方法使某种病原微生物与寄主或与其它混杂的微生物分开来，即取得纯 的病原菌。病原菌的分离是柯赫氏证病定律中所要求的证病过程的一步，对于确定病原是必 须的。分离的方法很多，最为常用的是组织分离法和稀释分离法，其它方法都是对这两种基 本方法进行某些改变以适应特殊的病原和寄主。但不论何种分离方法，分离工作中的一切过 程和措施都是围绕着取得纯菌这一目的，因此必须排除和防止任何其它来源的微生物的污 染，应该在无菌条件下进行工作。最好是在分离室内的超净工作台上进行，如果没有分离三 和超净工作台，可在一间较小的空气静止的室内进行。分离前应把门窗关上，把工作台擦洗 干净，然后在台面铺一块湿毛巾。摆好工作用具，以便操作。 (一)组织分离法 1,叶片、细根组织内病原菌的分离 此法适用于分离病原物的菌丝生长于寄主组织内部的病害，大多数病原真菌可用此法 分离。组织分离的基本过程是在无菌条件下取一块感病组织放到培养基上培养。切取的组 ·般应位于病健交界处，以减少腐生菌的污染。因为腐生菌容易在生病很久已枯死或频死的 部分滋生。分离的具体法如下： (1)用清水洗净感病材料，用剪刀在病健交界处剪取0.3一0.5cm×0.3一05cm大小的组 Q-10h (2)先将剪下的分离组织置于 70%的 酒精中浸2一3秒钟，以抽气除去附在寄主组织表面 的气泡，使消毒剂能与寄主表面完全接触。 (3)然后将分离组织迅速移到0.1%升汞(HgC1)液中浸泡1一5分钟，进行表面消毒， 杀死组织表面的杂菌。 (4)经升汞水处理后的组织再移到无黄水中洗涤1一3次，除去残留的消毒剂」 将组织移到有PDA培养基平板的培养皿内 每均匀理4块组红 (5)分离完成后，贴上标签，注明病害名称、分离时期、分离者，然后放到25一28℃ 温度下培养。 2.肥厚多肉的组织内病原菌的分高 (1)用解剂刀沾试管内的酒精涂于病部附近，然后在酒精灯上烧去酒精，作表面消毒
2 配制好的培养基必须经过灭菌后方能使用，培养基的灭菌一般是用高压蒸汽灭菌法（又 称湿热灭菌）。其原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。将要灭菌的培 养基、灭菌水等置于灭菌锅中，一般锅中加入 2000－4000 毫升（不同的高压灭菌锅加水的 量不同），密闭锅盖，打开排气活门，加热至锅内空气全部排除（可根据活门冲击的全部是 蒸汽时来确定排气是否彻底），即可关闭排气活门。锅内压力逐渐提高。当压力表指针达到 每平方时为 15 磅压力时（即 1.1 公斤/平方厘米，蒸汽温度相当于 121℃）时，开始计算灭 均时间，一般液体培养基保持 20－30 分钟；固体培养基保持 40－60 分钟，然后停止加温。 略微打开排气活门，使蒸汽慢慢排出来。当蒸汽全部排出后，即可打开锅盖，将培养基等取 出冷却。如需用固体斜面培养基，则将试管斜放在桌上冷却既成。 ４. 灭菌水的配制 量取 10 毫升的蒸馏水（或自来水）置试管中，加棉花塞后灭菌。 ５. 玻璃器皿的灭菌 培养用的玻璃器皿通常采用干热灭菌。方法是将需灭菌的器皿洗净擦干，用纸包好，或 放在金属盒内，置于干热灭菌箱（电烘箱）中，加温至 165－175℃，保持 1 小时后，即可 停加温。待温度逐渐下降到 40℃以下，才能打开温箱取用，避免由于高温骤然下降而引起 玻璃器皿破裂。 二、 病原真菌和细菌的分离 分离就是用人工方法使某种病原微生物与寄主或与其它混杂的微生物分开来，即取得纯 的病原菌。病原菌的分离是柯赫氏证病定律中所要求的证病过程的一步，对于确定病原是必 须的。分离的方法很多，最为常用的是组织分离法和稀释分离法，其它方法都是对这两种基 本方法进行某些改变以适应特殊的病原和寄主。但不论何种分离方法，分离工作中的一切过 程和措施都是围绕着取得纯菌这一目的，因此必须排除和防止任何其它来源的微生物的污 染，应该在无菌条件下进行工作。最好是在分离室内的超净工作台上进行，如果没有分离室 和超净工作台，可在一间较小的空气静止的室内进行。分离前应把门窗关上，把工作台擦洗 干净，然后在台面铺一块湿毛巾。摆好工作用具，以便操作。 （一） 组织分离法 1．叶片、细根组织内病原菌的分离 此法适用于分离病原物的菌丝生长于寄主组织内部的病害，大多数病原真菌可用此法 分离。组织分离的基本过程是在无菌条件下取一块感病组织放到培养基上培养。切取的组织 一般应位于病健交界处，以减少腐生菌的污染。因为腐生菌容易在生病很久已枯死或濒死的 部分滋生。分离的具体法如下： （1）用清水洗净感病材料，用剪刀在病健交界处剪取 0.3—0.5cm×0.3—0.5cm 大小的组织 8—10 块。 （2）先将剪下的分离组织置于 70%的酒精中浸 2—3 秒钟，以抽气除去附在寄主组织表面 的气泡，使消毒剂能与寄主表面完全接触。 （3）然后将分离组织迅速移到 0.1%升汞（HgＣl）液中浸泡１—５分钟，进行表面消毒， 杀死组织表面的杂菌。 （4）经升汞水处理后的组织再移到无菌水中洗涤１—３次，除去残留的消毒剂。 将组织移到有ＰＤＡ 培养基平板的培养皿内，每皿均匀地摆 4 块组织。 （5）分离完成后，贴上标签，注明病害名称、分离时期、分离者，然后放到２５—２８℃ 温度下培养。 2. 肥厚多肉的组织内病原菌的分离 （1）用解剖刀沾试管内的酒精涂于病部附近，然后在酒精灯上烧去酒精，作表面消毒
(2)用解剂刀从键部开始将组织剖开，但勿使刀子接触病部，切至接近病部时将组织撕开。 (3)用灭菌的接种针或解剖刀在病部前缘（病键交接处）挑取一块病组织直接放在PD培 养基上，每 (二) 稀释分离法 此法适用于细菌性病害和大量产孢的真菌病害的病原分离，病原细菌一般都是用稀释分 离法分离。 】培养皿稀释分离法：取灭黄培皿三个，每个培养皿内加05m无茵水，根据成病组 织性质情况进行表面消毒（与分离病原真菌同）后，用灭菌的解削刀或钱子将组织，碎 加授动，静置数分钟，使组织中的细茵流入水中即成菌液。用灭菌的接种环从第 一培养皿 移一环菌液到第二培养皿中与水充分混合后，从中移一环到第三培养皿中与水充分混合。将 三角瓶中的培养基溶化后冷却到45℃左右，将培养基倒入第二、第三培养皿内（每皿约倒 10m)并使皿内的菌液与倒入的培养基充分混合，冷却后，将培养皿翻转，置于恒温箱内 培养。 平板划线分离法：取小块病组织 ,经表面消毒后 ,置于盛有0.5ml无菌水的培养皿内 用镊子把病组织撕碎，制成菌液。用已灭菌的接种环沾取少许菌液，在制好的培养基平板上 划线，先在平板上半边顺序划五条线，再将培养皿转90度，将接种环灭菌后，在第二条上 划五条垂直线，划线的目的是使细菌分开，以便得到单个菌体长成的菌落。划好线后，将培 养皿翻转，置于恒温箱内培养 (三)注意事项： 切取的分离组织材料不宜太大块，否则污染的机会多 2. 表面消毒力求彻底而又不至于杀死组织内的病原菌，故必须掌握好消毒时间的长短。 3.操作及接种过程中都要在酒精灯火旁进行。分离过程不要讲话、走动，否则容易污染。 三、 病原真菌和细菌的人工接种 用人工的方法使寄生物接触和侵入寄主并诱导引起发病称为人工接种。人工接种是柯制 氏证病律中一项最重要的步骤，对大多数病原鉴定工作来说，接种是必须的。此外，植物病 害接种技术在寄主范围和品种抗病性的测定、病原致病性的变异、病害的发生和流行条件研 究以及防治试验中都有着广泛的应用。 接种主要是让病原与寄主接触并促进其发生侵染。因此。传播方式不同的病害要用不同 的方法接种，常用的有 资酒、淋根、制造伤口后接菌以及使用带菌、 带毒的媒介昆虫等方法 (一)孢子悬浮液的配制： 病原真菌进行人工接种时要配制一定浓度的孢子悬浮液。比较粗略的方法是在载玻片上 加1滴孢子悬浮液，加盖玻片后在低倍镜下检查孢子数，然后将原来的孢子悬浮液适当稀释， 使每个视野中达到一定的所需要的孢子数目。比较精确的方法是计测每毫升悬浮液中孢子的 数目。常使用纽鲍尔(Neubau )血 计数 血球计数计是一块很厚的载玻片，在板的中 央部分刻有400个(25大格×16小格)小方 ，总面积为1平方毫米，小格的深度是0. 毫米，当加盖玻片后，即成一个体积为01立方毫米的空间。每个小方格的边长为0.05毫米 每小格的面积是0.0025平方毫米，所以加盖玻片后每小格的容积是0.00025立方毫米，它的 容积是1/4000000毫米 测数时，牛将盖玻片放在血球计数计上右刻度的位置，从盖破片的一加1滴话当稀 的孢子悬浮液（使每小格中只有5 个孢子)，在低倍镜下找到板上的方格后，转到高倍镜 下计算孢子数，统计四个角上的四个大格和中央一个大格（共5个大格即80个小格）的孢 子数，按下列式计算每毫升悬浮液中分生孢子数目： 3
3 （2）用解剖刀从键部开始将组织剖开，但勿使刀子接触病部，切至接近病部时将组织撕开。 （3）用灭菌的接种针或解剖刀在病部前缘（病键交接处）挑取一块病组织直接放在 PDA 培 养基上，每皿放 4 块。 （二） 稀释分离法 此法适用于细菌性病害和大量产孢的真菌病害的病原分离，病原细菌一般都是用稀释分 离法分离。 １. 培养皿稀释分离法：取灭菌培养皿三个，每个培养皿内加０.５ml 无菌水，根据感病组 织性质情况进行表面消毒（与分离病原真菌同）后，用灭菌的解剖刀或镊子将组织撕碎，略 加搅动，静置数分钟，使组织中的细菌流入水中即成菌液。用灭菌的接种环从第一培养皿中 移一环菌液到第二培养皿中与水充分混合后，从中移一环到第三培养皿中与水充分混合。将 三角瓶中的培养基溶化后冷却到４５℃左右，将培养基倒入第二、第三培养皿内（每皿约倒 10ml）并使皿内的菌液与倒入的培养基充分混合，冷却后，将培养皿翻转，置于恒温箱内 培养。 ２. 平板划线分离法：取小块病组织，经表面消毒后，置于盛有 0.5ml 无菌水的培养皿内， 用镊子把病组织撕碎，制成菌液。用已灭菌的接种环沾取少许菌液，在制好的培养基平板上 划线，先在平板上半边顺序划五条线，再将培养皿转 90 度，将接种环灭菌后，在第二条上 划五条垂直线，划线的目的是使细菌分开，以便得到单个菌体长成的菌落。划好线后，将培 养皿翻转，置于恒温箱内培养。 （三）注意事项： 1. 切取的分离组织材料不宜太大块，否则污染的机会多。 2. 表面消毒力求彻底而又不至于杀死组织内的病原菌，故必须掌握好消毒时间的长短。 3. 操作及接种过程中都要在酒精灯火旁进行。分离过程不要讲话、走动，否则容易污染。 三、 病原真菌和细菌的人工接种 用人工的方法使寄生物接触和侵入寄主并诱导引起发病称为人工接种。人工接种是柯赫 氏证病律中一项最重要的步骤，对大多数病原鉴定工作来说，接种是必须的。此外，植物病 害接种技术在寄主范围和品种抗病性的测定、病原致病性的变异、病害的发生和流行条件研 究以及防治试验中都有着广泛的应用。 接种主要是让病原与寄主接触并促进其发生侵染。因此。传播方式不同的病害要用不同 的方法接种，常用的有喷洒、淋根、制造伤口后接菌以及使用带菌、带毒的媒介昆虫等方法。 （一）孢子悬浮液的配制： 病原真菌进行人工接种时要配制一定浓度的孢子悬浮液。比较粗略的方法是在载玻片上 加 1 滴孢子悬浮液，加盖玻片后在低倍镜下检查孢子数，然后将原来的孢子悬浮液适当稀释， 使每个视野中达到一定的所需要的孢子数目。比较精确的方法是计测每毫升悬浮液中孢子的 数目。常使用纽鲍尔（Neubauer）血球计数计。血球计数计是一块很厚的载玻片，在板的中 央部分刻有 400 个（25 大格×16 小格）小方格，总面积为 1 平方毫米，小格的深度是 0.1 毫米，当加盖玻片后，即成一个体积为 0.1 立方毫米的空间。每个小方格的边长为 0.05 毫米， 每小格的面积是 0.0025 平方毫米，所以加盖玻片后每小格的容积是 0.00025 立方毫米，它的 容积是 1/4000000 毫米。 测数时，先将盖玻片放在血球计数计上有刻度的位置，从盖玻片的一侧加 1 滴适当稀释 的孢子悬浮液（使每小格中只有 5—6 个孢子），在低倍镜下找到板上的方格后，转到高倍镜 下计算孢子数，统计四个角上的四个大格和中央一个大格（共 5 个大格即 80 个小格）的孢 子数，按下列式计算每毫升悬浮液中分生孢子数目:
80个小格内分生孢子总数 一×4000000=孢子数/海毫升 (二)土壤传染病害的接种： 常用的方法有土瑰接种法，箍根接种法，根部切伤接种法，桃根接种法的具体方法是 液然后把幼 的根部稍加损伤，在孢子悬浮液 中浸过以后移柱 (所用士 和种子经消毒处 这种方法使病茵能与根部直接接触，受 壤微生物的影响比较少，同时由于根上有损伤，病菌也容易侵入，效果比一股士壤接种法好， 此法常用于枯菱病、青枯病的接种，如测定品种的抗病性等工作。 (三)气流和雨水传播病害的接种 常用的方法有喷酒法、涂抹法、针刺法等。喷洒法的具体方法是：将病菌配制成一定浓 度（孢子 的孢子悬浮液 然后喷酒在 主表面。 对于从气孔侵入的病闲 ,则应注 喷洒叶背，叶背气孔的数目一般比叶面的多。对于伤口侵入的病菌，喷洒前应先将寄主表面 稍加损伤，如用细的砂土或金刚砂摩擦叶面。接种后用保湿罩保湿24小时，除去保湿罩。 四、杀菌剂的毒力测定和防效试验 (一)、毒性程度的表示 L.对人、的毒性：用LD0 一致死量来表示 -指杀死一群试验生物的半数(50%)所需用的剂量 名蘭灵对白鼠急性口服LD50>5000m/Kg 敌敌畏对白鼠急性口服LD5056一80me/K 2.对病原菌的毒性：用毒力和药效两个指标来表示。 毒力 一指杀菌剂对离体病原的直接毒杀或抑制作用 药效 指杀菌剂对病害的实际防治效果。是杀菌剂与多种外界因子综合在一起后对病菌的 毒杀效果，杀菌剂的药效除毒力因子外还受多方面的因素影响，如喷施时期、施药方法、外 界温度等等。 (二)、毒力测定的作用 1.确定某种杀菌剂对某种病菌是否具有毒杀或抑制作用。 2.从多种杀菌剂中筛选出毒力强的杀菌剂。 毒力测定试验的优点：①试验方法简便。②试验时间短，3一5天，甚至1天可出结果。 ③式哈经费少。 (三)蠢力测定方法 1. 孢子萌发法：①培养病茵孢子②将孢子悬浮液与供试杀菌剂混合后，滴于载玻片上回 在25℃温度下使孢子萌发，然后在显微镜下检查孢子萌发率，比较毒力大 2.抑菌圈法：①将病菌的孢子或菌丝悬浮液与培养基混合后均匀后倒入培养皿内制成平板 ②然后在培养基平面上放浸过药剂的小圆形滤纸片③置于25℃下培养3一5天后测定 抑菌圈的大小来比较毒力的强弱。 3。生长速率测定方法：通过测定病原菌在含有某种杀菌剂的培养基上的菌丝生长速度来证 明这 菌剂对该病菌的毒杀或抑制作用。 (四)药效试验方法： 毒力测定只能起到一个对杀菌剂初步筛选的作用，因为它是对病菌做的离体试验，有时 毒力测定的结果与药效试验的结果是有差异的，药效试验的结果是是杀菌剂在多种外界因素 综合作用下对病害的防治效果，与田间实际的药剂防治效果很接近，所以箭洗对某种病害的 杀菌试验往往先做毒力测定试验，可从多种杀菌剂种选出几种对病菌有毒杀作用的杀菌
4 80 个小格内分生孢子总数 ×4000000=孢子数/每毫升 80 （二）土壤传染病害的接种： 常用的方法有土壤接种法，蘸根接种法，根部切伤接种法，蘸根接种法的具体方法是： 将病菌配制成在低倍镜下约 15 个孢子的悬浮液然后把幼苗的根部稍加损伤，在孢子悬浮液 中浸过以后移植（所用土壤和种子经消毒处理）。这种方法使病菌能与根部直接接触，受土 壤微生物的影响比较少，同时由于根上有损伤，病菌也容易侵入，效果比一般土壤接种法好， 此法常用于枯萎病、青枯病的接种，如测定品种的抗病性等工作。 （三） 气流和雨水传播病害的接种： 常用的方法有喷洒法、涂抹法、针刺法等。喷洒法的具体方法是：将病菌配制成一定浓 度（孢子/毫升）的孢子悬浮液，然后喷洒在寄主表面。对于从气孔侵入的病菌，则应注意 喷洒叶背，叶背气孔的数目一般比叶面的多。对于伤口侵入的病菌，喷洒前应先将寄主表面 稍加损伤，如用细的砂土或金刚砂摩擦叶面。接种后用保湿罩保湿 24 小时，除去保湿罩。 四、杀菌剂的毒力测定和防效试验 （一）、毒性程度的表示 1. 对人、畜的毒性：用 LD50——致死量来表示。 LD50——指杀死一群试验生物的半数（50%）所需用的剂量。 多菌灵对白鼠急性口服 LD50＞5000mg/Kg 敌敌畏对白鼠急性口服 LD50 56—80mg/Kg 2. 对病原菌的毒性：用毒力和药效两个指标来表示。 毒力——指杀菌剂对离体病原的直接毒杀或抑制作用。 药效——指杀菌剂对病害的实际防治效果。是杀菌剂与多种外界因子综合在一起后对病菌的 毒杀效果，杀菌剂的药效除毒力因子外还受多方面的因素影响，如喷施时期、施药方法、外 界温度等等。 （二）、毒力测定的作用 1. 确定某种杀菌剂对某种病菌是否具有毒杀或抑制作用。 2. 从多种杀菌剂中筛选出毒力强的杀菌剂。 毒力测定试验的优点：①试验方法简便。②试验时间短，3—5 天，甚至 1 天可出结果。 ③试验经费少。 （三）毒力测定方法： 1. 孢子萌发法：①培养病菌孢子 ②将孢子悬浮液与供试杀菌剂混合后，滴于载玻片上 ③ 在 25℃温度下使孢子萌发，然后在显微镜下检查孢子萌发率，比较毒力大小 2. 抑菌圈法：①将病菌的孢子或菌丝悬浮液与培养基混合后均匀后倒入培养皿内制成平板 ②然后在培养基平面上放浸过药剂的小圆形滤纸片 ③置于 25℃下培养 3—5 天后测定 抑菌圈的大小来比较毒力的强弱。 3. 生长速率测定方法：通过测定病原菌在含有某种杀菌剂的培养基上的菌丝生长速度来证 明这种杀菌剂对该病菌的毒杀或抑制作用。 （四）药效试验方法： 毒力测定只能起到一个对杀菌剂初步筛选的作用，因为它是对病菌做的离体试验，有时 毒力测定的结果与药效试验的结果是有差异的。药效试验的结果是是杀菌剂在多种外界因素 综合作用下对病害的防治效果，与田间实际的药剂防治效果很接近，所以筛选对某种病害的 杀菌试验往往先做毒力测定试验，可从多种杀菌剂种选出几种对病菌有毒杀作用的杀菌剂
来，然后用这几种杀菌剂作盆裁药效试验或小区药效试验，最后选出防治效果好的杀菌剂在 生产上伸用。 ①做盆栽药效试验或小区药效试验一般都要进行人工接种，不接种难看出效果来。 ②每种药剂处理要设三次以上重复试验 ③要设对照，作为对比。 例如：菜心炭疽病盆栽药效试验 1.培养盆栽苗假若用5种杀菌剂来作试验 多己 每盆20株苗，4一5叶期 代森锰锌 每盆20株苗，4一5叶期 百菌清 5盆 每盆20株苗，4一5叶期 甲基拖布津 5名 每盆20株苗，4一5叶期。 世高 5法 每盆20株苗，4一5叶期。 5盆 每盆20株苗，4一5叶期。 2.喷药半小时后接种 3.记载发病程度和计算防治效果 ①直接记数法：就是调查发病植株的数目，然后从调查的总数求得发病百分率。 多菌灵处理：总数一一30 发病一一6 发病率(%)F 发病株数 6 -X100%= 总株数 -=20% 30 直接记数方法简单，但不能反映植株受害的严重程度，只活用于对那些受害程度比较 一的清破法·病吉发生有轻有配，如有的株只有个别片上发生少量的精高自有的 植株许多叶片上产生大量的病斑。它们都算是发病株，算出发病率是相同的，但实际受害程 度是不同的。所以直接记数法不能反映发病程度的差异。要反映出发病程度的差异，要采用 分级后再记数的方法。 制定分级标准（要求反映出发病程度的轻重来）。可以叶片为单位，以果实为单位，以 整株为单位 如菜心炭疽病以株为单位分为5级的分级标准： 0级 无病 1级 个别叶片产生病斑 2级 1/3以上的叶片上产生病安 2以上的叶片上产生病 23以上叶片产生病班，至整株枯死
5 来，然后用这几种杀菌剂作盆栽药效试验或小区药效试验，最后选出防治效果好的杀菌剂在 生产上使用。 ① 做盆栽药效试验或小区药效试验一般都要进行人工接种，不接种难看出效果来。 ② 每种药剂处理要设三次以上重复试验 ③ 要设对照，作为对比。 例如：菜心炭疽病盆栽药效试验 1. 培养盆栽苗 假若用 5 种杀菌剂来作试验 多菌灵 5 盆 每盆 20 株苗，4—5 叶期。 代森锰锌 5 盆 每盆 20 株苗，4—5 叶期。 百菌清 5 盆 每盆 20 株苗，4—5 叶期。 甲基拖布津 5 盆 每盆 20 株苗，4—5 叶期。 世高 5 盆 每盆 20 株苗，4—5 叶期。 对照 5 盆 每盆 20 株苗，4—5 叶期。 2. 喷药半小时后接种 3. 记载发病程度和计算防治效果。 ① 直接记数法：就是调查发病植株的数目，然后从调查的总数求得发病百分率。 多菌灵处理：总数——30 发病——6 发病率(%)= 发病株数 ×100%= 6 =20% 总株数 30 直接记数方法简单，但不能反映植株受害的严重程度，只适用于对那些受害程度比较一 致的病害的调查。 ② 分级记数法：病害发生有轻有重，如有的一株只有个别叶片上发生少量的病斑，但有的 植株许多叶片上产生大量的病斑。它们都算是发病株，算出发病率是相同的，但实际受害程 度是不同的。所以直接记数法不能反映发病程度的差异。要反映出发病程度的差异，要采用 分级后再记数的方法。 制定分级标准（要求反映出发病程度的轻重来）。可以叶片为单位，以果实为单位，以 整株为单位。 如菜心炭疽病以株为单位分为 5 级的分级标准： 0 级 无病 1 级 个别叶片产生病斑 2 级 1/3 以上的叶片上产生病斑 3 级 1/2 以上的叶片上产生病班 4 级 2/3 以上叶片产生病班，至整株枯死
菜心炭疽病盆载药效试验原始记录(1) 病情级别 病情 防治效果 杀菌剂与浓度 总株数 0 1 2 指数 (%) ①50%多菌灵 0.0 57.1 500倍 ②70%代森锰 0 71. 700倍 ③75%百菌清1： 700 78.6 ④70%甲基托 85.7 布律1：700日 ⑤80%世高1： 8.3 00倍 CK(水) 8 17 30 70.0 Σ（病株数×病级值） 病情指数① -X100 总株数×定的最高病级值 (0×7)+(1X10+(2×13) ×100 30×4 =30.0 病情指数⑥- (1×1)H(2X8)+3X17)+4X4 30×4 -×100=70.0 防治效果(%)= 对照病情指数处理病情指数 对照病情指数 -×100% 防治效果①= 70.0-30.0 ×100%=57.1% 70.0 五.实验报告格式 1.目的意义（作这项实验的目的）。 2实验方法（参考实验指导书）。 3实验结果（将实验原始数据整理成图表进行分析、病原物形态特征要求同时用文字和图描 述)。 4结论与讨论（根据实验结果作出结论）。 六.参考文献 1.方中达.植病研究方法M.北京：中国农业出版社，1998 2.陆家云.植物病害诊断M).北京：中国农业出版社，1997. 3.张中义.植物病原真南学机成都：四川科学出版社，1989 任欣正植物病原细菌的分类与鉴定M北京 中国农业出版社，1994 BuchananRE,.Gibbons NE.(中国科学院微生物研究所翻译组译.伯杰细菌鉴定手 6
6 菜心炭疽病盆载药效试验原始记录（Ⅰ） 杀菌剂与浓度 病情级别 总株数 病情 指数 防治效果 0 1 2 3 4 （%） ①50%多菌灵 500 倍 7 10 13 0 0 30 30.0 57.1 ②70%代森锰锌 700 倍 10 16 4 0 0 30 20.0 71.4 ③75%百菌清 1： 700 16 10 4 0 0 30 15.0 78.6 ④70%甲基托 布津 1：700 倍 18 12 0 0 0 30 10.0 85.7 ⑤80%世高 1： 800 倍 20 10 0 0 0 30 8.3 88.1 ⑥CK（水） 0 1 8 17 4 30 70.0 — 病情指数①= Σ(病株数×病级值) ×100 总株数×定的最高病级值 = (0×7)+(1×10)+(2×13) ×100 30×4 =30.0 病情指数⑥= (1×1)+(2×8)+(3×17)+(4×4) ×100=70.0 30×4 防治效果(%)= 对照病情指数-处理病情指数 ×100% 对照病情指数 防治效果①= 70.0-30.0 ×100% = 57.1% 70.0 五. 实验报告格式 1.目的意义（作这项实验的目的）。 2.实验方法（参考实验指导书）。 3.实验结果（将实验原始数据整理成图表进行分析、病原物形态特征要求同时用文字和图描 述）。 4.结论与讨论（根据实验结果作出结论）。 六. 参考文献 1. 方中达.植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1998. 2. 陆家云. 植物病害诊断[M]. 北京：中国农业出版社，1997. 3. 张中义. 植物病原真菌学[M]. 成都：四川科学出版社，1989. 4. 任欣正. 植物病原细菌的分类与鉴定[M]. 北京：中国农业出版社，1994. 5. Buchanan R E.,Gibbons N E. (中国科学院微生物研究所翻译组译). 伯杰细菌鉴定手
册（第8版）M.北京：科学出版社，1984 七.实验数据记录与处理参考表格 菜心炭疽病盆载药效试验原始记录(I) 杀菌剂与浓度 病情分级 总株数 病情 指数 备注 01234 注：(I)表示所设的重复1，（Ⅱ）表示处理所设的重复2。 表1不同杀菌剂对菜心炭疽菌的抑制作用 杀菌剂与浓度 菌落半径(mm) 抑制率显著性差异 IⅡIllI IV V Average (%) 50%1% 对照(CK)半径杀菌剂处理半径 注：抑制率= 对照(CK)半径 -×100% 7
7 册（第 8 版）[M]. 北京：科学出版社，1984. 七. 实验数据记录与处理参考表格 菜心炭疽病盆载药效试验原始记录（Ⅰ） 杀菌剂与浓度 病情分级 总株数 病情 指数 备注 0 1 2 3 4 注：（Ⅰ）表示所设的重复 1，（Ⅱ）表示处理所设的重复 2。 表 1 不同杀菌剂对菜心炭疽菌的抑制作用 杀菌剂与浓度 菌落半径（mm） 抑制率 （%） 显著性差异 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Average 5% 1% 注：抑制率= 对照（CK）半径-杀菌剂处理半径 ×100% 对照（CK）半径
表2不同杀菌剂对盆栽菜心炭疽菌的防治效果 杀茵剂与浓度 病情指数 防治效 显著性差异 果(%) IⅡIII IV V Average 5%1%
8 表 2 不同杀菌剂对盆栽菜心炭疽菌的防治效果 杀菌剂与浓度 病情指数 防治效 果（%） 显著性差异 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Average 5% 1%