华南农业大学：《果树栽培学》课程教学资源（实验指导）蔬菜系——植物显微技术综合性实验指导书.doc_大学文库

石蜡切制片实验指导目的要求：初步掌握以石蜡包埋软质材料后切制片的方法，以便进一步观察材料的内部结构选择实验材料、固定、脱水、透明、渗蜡、包理、切片、制片，用显微镜镜检、观察摄影，根据实验结果写出实验报告。整个过程大约需要1个月时间，锻炼了学生独立解决问题和分析问题的能力。材依研究方向选定根尖、茎端、叶片、胚胎（按授粉后不同时期取样）等材料仪器、用具及药品染料光学显微镜双目解剂显微镜恒温培养箱旋转式切片机水浴锅电炉温台塑料盆粗天平软胶管指形玻璃管塑料网（网孔小于材料）橡胶圈烧杯(300、 1000毫升)镊子解剖针、刀指形瓶（或小药瓶）滴管胶带纸标签纸蜡勺熔蜡锅熔蜡盅铝薄片活套盒铜网《网孔小于材料)白报纸道林纸玻璃片3毫米 5毫米) 温度计石桑皮纸漏斗回形量筒三角架培养剪刀接蜡台木毛笔小蜡酒精灯双面刀片载玻片盖玻片滴瓶漏斗架蜡光纸载玻片托板载玻片木盆洗耳球精支纱抹布滤纸立式染缸火柴石蜡蒸馏水各级酒精纯氯仿二甲苯明胶1%苯胺番红（水或70%酒精配）1%苯胺固绿(95%酒精配)1%醇溶曙红B石炭酸甘油中性树脂胶明胶粘贴剂Navashin'sⅢ式固定四、操作步骤 1、取材：（每号中的数量酌情而定） (1)先萌发种子待根尖发生约0.5~1厘米长（示种子大小而定）用双面刀片截取根尖约2~5毫米长（纵切）. (2)选取根系中较柔软的根部载取成约3一5亭米长小段（不过5亭米）（可织横切) (3)取茎瑞剥去真叶及幼叶（纵切）。 (4)取叶片剪取叶主脉中部旁的叶片约3~5毫米3~5毫米小方块（叶主脉小于3毫米者可连同主脉一起剪取)。 (5)取受精前与受精后刚开始发有的子房截取成3~5毫米小段（可纵、横切）。 2、固定：以上各号材料分别置aa5hnS式固定液中固定24小时以 3、冲洗：以上各号材料分别编号入冲洗笼中自来水冲洗一天后大烧杯中浸水过夜，最后蒸馏水浸1小时。 4、脱水：采用15%、30%、50%、70%、85%、95%无水酒精，逐级脱水，每级可自 1~6小时不等，示材料性质、大小而定（必要时可在70%酒精中停留过夜或1~2天：脱水至95%酒精时可在脱水烧杯中加入少量1%醇溶红色染液使材料稍有着色，以便包埋时易于辨认) 5、透明：采用5级氯仿透明，每级停留0.5~6小时。材料脱水至无水酒精后细有等引 5分格标记的小指形瓶中，并浸于无水酒精至5格处，后逐级换入氯仿，即各次吸出1格，加入1格氯仿，最后一级全部吸出，再换一次氯仿至2.5格处。（氯仿集中回收）。 6、浸蜡：材料继续在氯仿中加蜡渗透，可分三次加入，第一次加到3.5格处，第二次加至4.5格处，次加至5格处 ,每次加蜡相隔约小时，前两次可在38℃ 40℃恒温水浴锅中进行，每三次加蜡后可移入38℃~40℃恒温培养箱中过夜，并继续浸蜡2~3天。然后将材料分别对号移至铜网活底的铝片活套浸蜡盒中，并将各号汇成一整体继续分级浸蜡，分级浸蜡在恒温培养箱内进行，分别事先准备好7个蜡锅，锅外标明50%(50%石蜡

石蜡切制片实验指导一、目的要求：初步掌握以石蜡包埋软质材料后切制片的方法，以便进一步观察材料的内部结构。选择实验材料、固定、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、制片，用显微镜镜检、观察摄影，根据实验结果写出实验报告。整个过程大约需要 1 个月时间，锻炼了学生独立解决问题和分析问题的能力。二、材料：依研究方向选定根尖、茎端、叶片、胚胎（按授粉后不同时期取样）等材料。三、仪器、用具及药品、染料：光学显微镜双目解剖显微镜恒温培养箱旋转式切片机水浴锅电炉温台塑料盆粗天平软胶管指形玻璃管塑料网（网孔小于材料）橡胶圈烧杯（300、 1000 毫升）镊子解剖针、刀指形瓶（或小药瓶）滴管胶带纸标签纸蜡勺熔蜡锅熔蜡盅铝薄片活套盒铜网（网孔小于材料）白报纸道林纸玻璃片（3 毫米、 5 毫米）温度计石棉网桑皮纸漏斗回形针量筒三角架培养皿剪刀接蜡台木毛笔小蜡铲酒精灯双面刀片载玻片盖玻片滴瓶漏斗架蜡光纸载玻片托板载玻片木盒洗耳球精支纱抹布滤纸立式染缸火柴石蜡蒸馏水各级酒精纯氯仿二甲苯明胶 1%苯胺番红（水或 70%酒精配） 1%苯胺固绿（95%酒精配） 1%醇溶曙红 B 石炭酸甘油中性树脂胶明胶粘贴剂 Navashin’s Ⅲ式固定液四、操作步骤 1、取材：（每号中的数量酌情而定）（1）先萌发种子待根尖发生约 0.5～1 厘米长（示种子大小而定）用双面刀片截取根尖约 2～5 毫米长（纵切）。（2）选取根系中较柔软的根部截取成约 3～5 毫米长小段（宽不超过 5 毫米）（可纵、横切）。（3）取茎端剥去真叶及幼叶（纵切）。（4）取叶片剪取叶主脉中部旁的叶片约 3～5 毫米*3～5 毫米小方块（叶主脉小于 3 毫米者可连同主脉一起剪取）。（5）取受精前与受精后刚开始发育的子房截取成 3～5 毫米小段（可纵、横切）。 2、固定：以上各号材料分别置 Navashin’sⅢ式固定液中固定 24 小时以上 3、冲洗：以上各号材料分别编号入冲洗笼中自来水冲洗一天后大烧杯中浸水过夜，最后蒸馏水浸 1 小时。 4、脱水：采用 15％、30％、50％、70％、85％、95％无水酒精，逐级脱水，每级可自 1～6 小时不等，示材料性质、大小而定（必要时可在 70％酒精中停留过夜或 1～2 天; 脱水至 95％酒精时可在脱水烧杯中加入少量 1％醇溶红色染液使材料稍有着色，以便包埋时易于辨认）。 5、透明：采用 5 级氯仿透明，每级停留 0.5～6 小时。材料脱水至无水酒精后画有等距 5 分格标记的小指形瓶中，并浸于无水酒精至 5 格处，后逐级换入氯仿，即各次吸出 1 格，加入 1 格氯仿，最后一级全部吸出，再换一次氯仿至 2.5 格处。（氯仿集中回收）。 6、浸蜡：材料继续在氯仿中加蜡渗透，可分三次加入，第一次加到 3.5 格处，第二次加至 4.5 格处，第三次加至 5 格处，每次加蜡相隔约 1 小时，前两次可在 38℃～40℃恒温水浴锅中进行，每三次加蜡后可移入 38℃～40℃恒温培养箱中过夜，并继续浸蜡 2～3 天。然后将材料分别对号移至铜网活底的铝片活套浸蜡盒中，并将各号汇成一整体继续分级浸蜡，分级浸蜡在恒温培养箱内进行，分别事先准备好 7 个蜡锅，锅外标明 50％（50％石蜡

50%二甲苯)，75%(75%石蜡、25%二甲苯)，A、B、C、包埋。过滤等7种字样，（后5 锅均匀炼好的纯蜡)。每级换蜡时只需整体提起活套合使蜡漏下，然后转入下一级蜡锅，各级蜡锅温度及浸蜡时间如下 50%蜡 40-420 0.5~3小时 75%蜡 46-48℃ 0.5-3小时 A银纯蜡 52-54℃ 20分钟~1小时 B品纯 52-54℃ 广按蜡塔点 20分钟一1小时 C锅 52~54 20分钟1 1小时 7、包埋：事先准备好水浴锅恒温60~70℃，用道林纸先折好纸船，大小示材料大、小、多、少而定，分别编号写好小标签（有字一面朝纸船边平放）。镊子、蜡勺，6*8厘米玻璃片若干、薄纸若干（比纸船大2一4厘米），15*20厘米厚玻璃一块，冷水一盆。包埋前先在恒温(6070℃)水浴锅上将包埋纯错融化，蜡勺、摄子浸入错中：水浴制上放上厚玻璃再在其上放68厘米玻药片其上放比纸船大足厘米的薄纸上放纸船然后用蜡勺将包埋纯站倒入纸盒，厚度约1米配合从恒温培养箱中取出同号活套蜡合在纸船上拆开使材料落进纸船内，用热镊子迅速拨动材料，依所需的切面朝纸船底，按每材料约相隔1厘米排列齐整，然后拿起玻璃片平放于冷水盆中，慢慢挪开玻璃片剩下湿纸托着纸船浮于水面渐冷却凝固。如此依次将全部材料包理完毕，最后剥去纸船制成包埋蜡块待下步切片。包埋完毕应及时清洗用 8、蜡块分割与固若修整切片前按编号将蜡块分割成小块，每一小块内只有一材料然后将小蜡块修整成长方形六面体，六面均不使材料暴露，且六面的蜡面均平整，小蜡块四边要平行，材料四周要留下部分石蜡，接者用温热的金属小蜡铲将小蜡块底部固者在台木正中，在小蜡块基部的周围再添加一些熔化了的石蜡，再用小刀将材料前后左右12毫米以外的错修去。（固若的蜡台要分别标记绵号，勿错乱材料） 9、切片：装好蜡台及夹好双面刀片调整好固着装置，使材料的切面与切片刀口平行材料的纵横与刀口垂直，并尽可能蜡块对者刀片的中间使用力均匀而稳周，刀片夹的倾斜调整至合度调整好切片厚度一般6一12微米之间。开始旋转切片，左手执毛笔，、右手转动切片机，由于连继旋转摩擦生热使切下的蜡片粘成蜡带，过长可分段。 10、贴片、展片与烤干：蜡片切好，根据需要粘贴到净的载玻片上，粘贴蜡片前先二小滴明胶粘贴剂于载玻片上用手指涂抹极薄的层然后再滴上数滴蒸箱水再将经镜检符合一要求的蜡片镊于水面平置于展台上展片加温至37 0 玻片让多余的水流去，用滤纸拨正材料位置，继续放展片台上烤干表面水分，或在恒温35 一40度水浴锅中展好片再移至载玻片上，再转至恒温培养箱40度左右3小时以上继续烤干。务必干透，免至下一步脱蜡时材料脱落 11、脱蜡、地色及封意：（采用番红、固绿对垫滴垫法》 (1)将烤干的切片置盛二甲苯的立体式染缸中脱蜡15一60分钟至脱蜡干净，冬天甚至达数小时。 (2)再换入另一盛二甲苯立式染缸中透明待染。 (3)取出切片滴以无水酒精，倾去 (4)滴以95%酒精，倾去（以下操作均同此步）。 (5)加蒸馏水少许于材料上 (6)1%苯胺番红（水溶）滴染1一5分钟，视材料而定，甚至更长。 (7)蒸馏水去浮色至无染液渗出： (8)95%酒精脱水及进一步去浮色。 (9)1%苯胺周绿(95%酒精配)复染20秒到2分钟

｝ 50％二甲苯），75％（75％石蜡、25％二甲苯），A、B、C、包埋。过滤等 7 种字样，（后 5 锅均匀炼好的纯蜡）。每级换蜡时只需整体提起活套合使蜡漏下，然后转入下一级蜡锅，各级蜡锅温度及浸蜡时间如下： 50%蜡 40～42℃ 0.5～3 小时 75%蜡 46～48℃ 0.5～3 小时Ａ锅纯蜡 52～54℃ 20 分钟～1 小时Ｂ锅纯蜡 52～54℃ 按蜡熔点 20 分钟～1 小时Ｃ锅纯蜡 52～54℃ 20 分钟～1 小时 7、包埋：事先准备好水浴锅恒温 60～70℃，用道林纸先折好纸船，大小示材料大、小、多、少而定，分别编号写好小标签（有字一面朝纸船边平放）。镊子、蜡勺，6*8 厘米玻璃片若干、薄纸若干（比纸船大 2～4 厘米），15*20 厘米厚玻璃一块，冷水一盆。包埋前先在恒温（60～70℃）水浴锅上将包埋纯蜡融化，蜡勺、镊子浸入蜡中; 水浴锅上放上厚玻璃再在其上放 6*8 厘米玻璃片，其上放比纸船大 2～4 厘米的薄纸，上放纸船。然后用蜡勺将包埋纯蜡倒入纸盒，厚度约 1 厘米，配合从恒温培养箱中取出同号活套蜡合，在纸船上拆开使材料落进纸船内，用热镊子迅速拨动材料，依所需的切面朝纸船底，按每材料约相隔 1 厘米排列齐整，然后拿起玻璃片平放于冷水盆中，慢慢挪开玻璃片剩下湿纸托着纸船浮于水面渐冷却凝固。如此依次将全部材料包埋完毕，最后剥去纸船制成包埋蜡块待下步切片。包埋完毕应及时清洗用具。 8、蜡块分割与固着修整：切片前按编号将蜡块分割成小块，每一小块内只有一材料，然后将小蜡块修整成长方形六面体，六面均不使材料暴露，且六面的蜡面均平整，小蜡块四边要平行，材料四周要留下部分石蜡，接着用温热的金属小蜡铲将小蜡块底部固着在台木正中，在小蜡块基部的周围再添加一些熔化了的石蜡，再用小刀将材料前后左右 1～2 毫米以外的蜡修去。（固着的蜡台要分别标记编号，勿错乱材料）。 9、切片：装好蜡台及夹好双面刀片，调整好固着装置，使材料的切面与切片刀口平行，材料的纵横与刀口垂直，并尽可能蜡块对着刀片的中间使用力均匀而稳固，刀片夹的倾斜调整至合度调整好切片厚度一般 6～12 微米之间。开始旋转切片，左手执毛笔，、右手转动切片机，由于连继旋转摩擦生热使切下的蜡片粘成蜡带，过长可分段。 10、贴片、展片与烤干：蜡片切好，根据需要粘贴到干净的载玻片上，粘贴蜡片前先沾一小滴明胶粘贴剂于载玻片上用手指涂抹极薄的层然后再滴上数滴蒸馏水再将经镜检符合要求的蜡片镊于水面平置于展台上使展片加温至 37—40 度，待蜡片完全伸展后略倾斜载玻片让多余的水流去，用滤纸拨正材料位置，继续放展片台上烤干表面水分，或在恒温 35 —40 度水浴锅中展好片再移至载玻片上，再转至恒温培养箱 40 度左右 3 小时以上继续烤干。务必干透，免至下一步脱蜡时材料脱落。 11、脱蜡、染色及封藏：（采用番红、固绿对染滴染法）（1）将烤干的切片置盛二甲苯的立体式染缸中脱蜡 15—60 分钟至脱蜡干净，冬天甚至达数小时。（2）再换入另一盛二甲苯立式染缸中透明待染。（3）取出切片滴以无水酒精，倾去。（4）滴以 95%酒精，倾去（以下操作均同此步）。（5）加蒸馏水少许于材料上。（6）1%苯胺番红（水溶）滴染 1—5 分钟，视材料而定，甚至更长。（7）蒸馏水去浮色至无染液渗出。（8）95%酒精脱水及进一步去浮色。（9）1%苯胺固绿（95%酒精配）复染 20 秒到 2 分钟