四川解剖学杂志2009年第17卷第1期 ·31 选取10只胎鼠脑组织置于甲醛液固定，石蜡包埋切 1材料与方法 片（厚度为5um),采用免疫组化SP法染色，切片常 1.1仪器与主要试剂透射电镜(JEM-1230型，日 规脱蜡至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波 本产)；普通红三环过滤嘴香烟（安徽巢湖卷烟厂）：兔 修复抗原，滴加正常山羊血清室温下孵育30min,再 抗大鼠NGF、羊抗兔IgG、DAB显色剂均购于北京中 依序滴加一抗(1：400)，4℃过夜，次日PBS液洗涤 杉公司。 后滴加生物素标记的羊抗兔IgG,于37℃温箱孵育1 1.2实验动物及被动吸烟动物模型制备普通级雕 h,链霉素抗生物素-过氧化酶溶液复合物室温下孵有 性SD大鼠24只，体重180~250g,由安徽医科大学 10min,于37C温箱孵育1h、最后在室温下加DAB 实验动物中心提供。随机分成实验组和对照组，每组 显色l0min,清水洗涤、脱水、透明、封片和镜检。 12只。实验组大鼠在孕前吸烟一周直至分娩，对照 1.5图像分析采用Image-Pro Plus图像分析系 组12只大鼠不予被动吸烟。被动吸烟在特制的半封 统对免疫组织化学染色的切片进行摄片，并检测海马 闭的熏烟箱中进行，自制熏烟箱为55cm×40cm× 神经元内免疫组化染色的NGF的平均光密度值。 40cm,一侧留有8cmX8cm的通风口。每日被动吸 1.6统计方法所有数据采用SS11.0软件进行统 烟2次，每次40min,每次点燃10支香烟，按照3十3 计分析，以x士s表示，组间比较采用t检验。P< 十4的顺序（即依次分别点燃3支、3支和4支香烟直 0.05为差异有统计学意义。 至燃尽，保持烟雾浓度一定)自燃至灰烬。两组大鼠 常规饮食、饮水。孕鼠于受孕第21天行剖宫取胎，新 2结果 鲜胎鼠脑组织置于戊二醛中固定。 2.1电镜结果对照组胎鼠海马区神经元核膜清晰 1.3电镜观察胎鼠海马组织常规脱水，经环氧树 完整，粗面内质网及核糖体较丰富，线粒体嵴结构清 脂包埋后进行超薄切片，片厚70nm,水洗后入醋酸 晰，可见初级溶酶体和次级溶酶体（图1）；实验组胎 铀饱和水溶液，再入枸橼酸铅染液染色，日产JEM- 鼠海马区神经元染色质边集，细胞内水泡样物质形成 1230型透射电镜观察。 (图2)；部分线粒体嵴断裂或空泡样变性（图3）。 1.1免疫组织化学染色 实验组和对照组分别随机 图1对照组胎鼠海马神经元核膜清晰图2实验组胎鼠海马神经元染色质边集 图3实验组胎鼠海马神经元内线粒体 (◆)粗而内质网及核糖体较正常（▲）（↑)细胞内水泡样物质形成（▲）×10000 嵴断裂，空泡样变性（△）×20000 线杠体嵴结构清浙（△） 2.2免疫组化结果NGF主要分布于海马神经细 胞的胞浆内，呈棕黄色。对照组染色深，在胞浆内可 见大量棕黄色颗粒；实验组染色较浅，棕黄色颗粒少 (图4,5)。经Image-Pro Plus图像分析系统，对照组 胎鼠海马NGF表达平均光密度为0.2609土0.0619 ,实验组胎鼠海马NGF表达平均光密度为0.2003士 0.0283,两组数据经统计学比较后有显著性差异(P 图4对照组胎鼠海马NGF图5实验组胎鼠海马NGF <0.05)(表1)。 表达×400 表达×400四 川 解 剖 学 杂 志 2009年 第 17卷 第 1期 · 31 · 1 材料与方法 1．1 仪器与主要试剂 透射电镜 (JEM-1230型 ，日 本产)；普通红三环过滤嘴香烟 (安徽巢湖卷烟厂)；兔 抗大 鼠NGF、羊抗兔 IgG、DAB显色剂均购于北京 中 杉 公 司 。 1．2 实验动物及被动吸烟动物模型制备 普通级雌 性 SD大 鼠 24只，体重 180~250g，由安徽医科大学 实验动物中心提供 。随机分成实验组和对照组，每组 12只 。实验组大 鼠在孕前吸烟一周直至分娩 ，对 照 组 l2只大鼠不予被动吸烟。被动吸烟在特制的半封 闭的熏烟箱中进行 ，自制熏烟箱为 55cm ×40cm x 40cm，一侧留有 8cmX8cm的通风 口。每 日被动吸 烟 2次 ，每次 40min，每次点燃 10支香烟 ，按照 3+3 +4的顺序(即依次分别点燃 3支 、3支和 4支香烟直 至燃尽 ，保持烟雾浓度一定)自燃至灰烬 。两组大 鼠 常规饮食 、饮水 。孕 鼠于受孕第 21天行剖宫取胎 ，新 鲜胎鼠脑组织置于戊二醛中固定 。 1．3 电镜观察 胎 鼠海马组织常规脱水 ，经环氧树 脂包埋后进行超薄切片，片厚 70nm，水洗后人醋酸 铀饱和水溶液 ，再 人枸橼酸铅染液染色 ，日产 JEM- 1230型透射 电镜观察 。 1．4 免疫组织化学染色 实验组和对照组分别随机 图 1对照组胎 鼠海马神经元核膜清晰 (十)粗而 内质 网及核糖体较正常 (▲) 线杠体嵴结构清 晰(△ )，、_ -t 选取 10只胎 鼠脑组织置于 甲醛液固定 ，石蜡包埋切 片(厚度为 5 m)，采用免疫组化 SP法染色，切片常 规脱蜡至水，3 HzOz封闭 内源性过 氧化物酶 ，微 波 修复抗原 ，滴加正常山羊血清室温下孵育 30min，再 依序滴加一抗(1：400)，4℃过夜 ，次 日PBS液洗涤 后滴加生物素标记的羊抗兔 IgG，于 37℃温箱孵育 1 h，链霉素抗生物素一过氧化酶溶液复合物室温下孵育 10rain，于 37℃温箱孵育 1h、最后在室温下加 DAB 显色 10min，清水洗涤 、脱水 、透明、封片和镜检 。 1．5 图像分析 采用 Image-ProPlus图像 分析系 统对免疫组织化学染色的切片进行摄片，并检测海马 神经元 内免疫组化染色的 NGF的平均光密度值 。 1．6 统计方法 所有数据采用 SS11．0软件进行统 计分析 ，以 X±S表示 ，组 间 比较采用 t检 验。P< 0．05为差异有统计学意义。 2 结果 2．1 电镜结果 对照组胎鼠海马区神经元核膜清晰 完整 ，粗面内质网及核糖体较丰富 ，线粒体嵴结 构清 晰，可见初级溶酶体 和次级溶酶体 (图 1)；实验组胎 鼠海马区神经元染色质边集 ，细胞内水泡样物质形成 (图 2)；部分线粒体嵴断裂或空泡样变性(图 3)。 图 2实验组胎 鼠海马神经元染色质边集 (十)细胞 内水泡样物质形成 (▲)×10000 图 4 对 照组胎 鼠海马 NGF 图 5 实验组胎鼠海 马 NGF 表达 X400 表达×400 图 3实验组胎 鼠海 马神经元 内线粒体 嵴断裂 ，空泡样变性 (△ )×20000 2．2 免疫组化结果 NGF主要分布于海马神经细 胞的胞浆 内，呈棕黄色。对 照组染色深 ，在胞浆 内可 见大量棕黄色颗粒 ；实验组染色较浅 ，棕黄色颗粒少 (图 4，5)。经 Image-ProPlus图像分析系统 ，对照组 胎鼠海马 NGF表达平均光密度为 0．2609±0．0619 ， 实验组胎鼠海马 NGF表达平均光密度为 0．2003± 0．0283，两组数据经统计学 比较后有显著性差异 (P <O．05)(表 1)