2、显微注射 优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。 ÷缺点：在导入DNA时需要一个细胞一个细胞地注射，不适合大量转染细 胞研究的需要。 3、磷酸钙共沉淀法 原理：磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。氯化钙+DNA+ 磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细 胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。 优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染都可以。 缺点： 1)转染效率低：进入细胞的DNA只有1%一5%可以进入细胞核，其中只有 不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。 2)重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育 时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。 4、脂质体介导的转染 原理：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而 吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 特点： ◆适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 ◆转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。 ◆能够把DNA和RNA转染到各种细胞。 ◆转染的稳定性好，可重复性高。 5、病毒介导的转染 冬优点：整和效率高，可使外源基因在宿主细胞中长期表达。 冬缺点：存在潜在的安全危险性。 (四)影响细胞转染效率的主要因素 1、细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。 不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度。一般推荐在转染前24小时将细胞传代， 这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。 2、血清 ◆血清质量的变化直接影响转染效率。 ◆脂质体转染在有血清存在情况下效率较低，因为血清会影响复合物的形成。 有些对血清敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡，导致转染效率 极低。2、显微注射 ❖ 优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。 ❖ 缺点：在导入 DNA 时需要一个细胞一个细胞地注射，不适合大量转染细 胞研究的需要。 3、磷酸钙共沉淀法 原理：磷酸钙被认为有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合。氯化钙+DNA+ 磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA 复合物沉淀黏附在细 胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。 优点：能用于任何 DNA 导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染都可以。 缺点： 1）转染效率低：进入细胞的 DNA 只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有 不到１％的 DNA 可以与细胞 DNA 整合，在细胞中进行稳定表达。 2）重复性不佳： pH 值、钙离子浓度、DNA 浓度、沉淀反应时间、细胞孵育 时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。 4、脂质体介导的转染 原理：中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA，借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成 DNA-阳离子脂质体复合物，从而 吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 特点： ◆ 适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 ◆ 转染效率高，比磷酸钙法高 5-100 倍。 ◆ 能够把ＤＮＡ和ＲＮＡ转染到各种细胞。 ◆ 转染的稳定性好，可重复性高。 5、病毒介导的转染 ❖ 优点：整和效率高, 可使外源基因在宿主细胞中长期表达。 ❖ 缺点：存在潜在的安全危险性。 （四） 影响细胞转染效率的主要因素 1、细胞培养物 ➢ 健康的细胞培养物是成功转染的基础。 ➢ 不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。 ➢ 高的转染效率需要一定的细胞密度。一般推荐在转染前24 小时将细胞传代， 这样可提供正常细胞代谢，增加对外源 DNA 摄入的可能。 2、血清 ◆ 血清质量的变化直接影响转染效率。 ◆ 脂质体转染在有血清存在情况下效率较低，因为血清会影响复合物的形成。 ◆ 有些对血清敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡，导致转染效率 极低