教案首页 第1次课 授课时间2016.11 教案完成时间：2016.11 课程名称 生殖医学相关的 分子生物技术 年级 2016 专业、层次 研究生 助理 授课教师 刘雅静 专业技术 授课方式 职务 研究员 (大、小班) 小班 学时 2 第1章、生殖医学相关的分子生物技术 授课题目（章，节） 第一节、转染技术 第二节、RNA干扰技术 基本教材或主要参考书 1. 《医学分子生物学技术》（第3版）药立波主编 2. 《医学分子生物学》武军驻主编 教学目的与要求： 1、 熟练掌握转染技术的基本概念以及几种转染方式的优缺点。 2、 掌握影响细胞转染效率的各种因素。 3、 熟练掌握RNA干扰技术的概念
教案首页 第 1 次课 授课时间 2016.11 教案完成时间：2016.11 课程名称 生殖医学相关的 分子生物技术 年 级 2016 专业、层次 研究生 授课教师 刘雅静 专业技术 职务 助理 研究员 授课方式 （大、小班） 小班 学时 2 授课题目（章，节） 第 1 章、生殖医学相关的分子生物技术 第一节、转染技术 第二节、RNA 干扰技术 基本教材或主要参考书 1. 《医学分子生物学技术》 （第 3 版） 药立波 主编 2. 《医学分子生物学》 武军驻 主编 教学目的与要求： 1、 熟练掌握转染技术的基本概念以及几种转染方式的优缺点。 2、 掌握影响细胞转染效率的各种因素。 3、 熟练掌握 RNA 干扰技术的概念
(教案续页) 辅助手段和 基本内容 时间分配 概述 分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律 的科学。 第一节、转染技术 (一)医学分子生物学的基本概念 医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在 正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。 医学分子生物学主要研究人体生物大分子（基因，蛋白质）和大分子体系 的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。 与生殖相关的分子生物学技术主要包括转染技术、PCR技术、RNA干扰技 术、DNA序列分析技术、Souther印迹技术、Northem印迹技术、Westem印 迹技术、免疫组织化学技术等。 (二)转染技术的基本概念 转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术，它是研究 基因表达调控，突变分析等的常规工具。 转染途径主要包括以下几种： 冬物理介导：电穿孔法、显微注射、基因枪 冬化学介导：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法 冬生物介导：原生质体转染、病毒介导的转染 (三)各种转染方法的原理与特点 1、电穿孔法 电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。 本法需用特殊仪器（电穿孔仪），把悬浮状态的受体细胞和供体DNA共同放入皿 中，再施以高压电脉冲，能够促进DNA通过细胞膜而进入细胞内， 并可整合到细胞的DNA中，使细胞发生转化。 优点：转染效率较高 冬缺点： >需要昂贵的仪器（电穿孔仪）。 >对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA。 每种细胞电转的条件都需要进行多次优化
（教案续页） 基 本 内 容 辅助手段和 时间分配 概述 分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律 的科学。 第一节、转染技术 （一） 医学分子生物学的基本概念 医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在 正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。 医学分子生物学主要研究人体生物大分子（基因，蛋白质）和大分子体系 的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。 与生殖相关的分子生物学技术主要包括转染技术、PCR 技术、RNA 干扰技 术、DNA 序列分析技术、Souther 印迹技术、Northern 印迹技术、Western 印 迹技术、免疫组织化学技术等。 （二） 转染技术的基本概念 转染技术是指将外源分子如 DNA，RNA 等导入真核细胞的技术，它是研究 基因表达调控，突变分析等的常规工具。 转染途径主要包括以下几种： ❖ 物理介导：电穿孔法、显微注射、基因枪 ❖ 化学介导：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法 ❖ 生物介导：原生质体转染 、病毒介导的转染 （三） 各种转染方法的原理与特点 1、 电穿孔法 电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。 本法需用特殊仪器（电穿孔仪），把悬浮状态的受体细胞和供体 DNA 共同放入皿 中，再施以高压电脉冲，能够促进 DNA 通过细胞膜而进入细胞内， 并可整合到细胞的 DNA 中，使细胞发生转化。 ❖ 优点：转染效率较高 ❖ 缺点： ➢ 需要昂贵的仪器 （电穿孔仪）。 ➢ 对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和 DNA。 ➢ 每种细胞电转的条件都需要进行多次优化
2、显微注射 优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。 ÷缺点：在导入DNA时需要一个细胞一个细胞地注射，不适合大量转染细 胞研究的需要。 3、磷酸钙共沉淀法 原理：磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。氯化钙+DNA+ 磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细 胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。 优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染都可以。 缺点： 1)转染效率低：进入细胞的DNA只有1%一5%可以进入细胞核，其中只有 不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。 2)重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育 时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。 4、脂质体介导的转染 原理：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而 吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 特点： ◆适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 ◆转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。 ◆能够把DNA和RNA转染到各种细胞。 ◆转染的稳定性好，可重复性高。 5、病毒介导的转染 冬优点：整和效率高，可使外源基因在宿主细胞中长期表达。 冬缺点：存在潜在的安全危险性。 (四)影响细胞转染效率的主要因素 1、细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。 不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度。一般推荐在转染前24小时将细胞传代， 这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。 2、血清 ◆血清质量的变化直接影响转染效率。 ◆脂质体转染在有血清存在情况下效率较低，因为血清会影响复合物的形成。 有些对血清敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡，导致转染效率 极低
2、显微注射 ❖ 优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。 ❖ 缺点：在导入 DNA 时需要一个细胞一个细胞地注射，不适合大量转染细 胞研究的需要。 3、磷酸钙共沉淀法 原理：磷酸钙被认为有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合。氯化钙+DNA+ 磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA 复合物沉淀黏附在细 胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。 优点：能用于任何 DNA 导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染都可以。 缺点： 1）转染效率低：进入细胞的 DNA 只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有 不到１％的 DNA 可以与细胞 DNA 整合，在细胞中进行稳定表达。 2）重复性不佳： pH 值、钙离子浓度、DNA 浓度、沉淀反应时间、细胞孵育 时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。 4、脂质体介导的转染 原理：中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA，借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成 DNA-阳离子脂质体复合物，从而 吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 特点： ◆ 适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 ◆ 转染效率高，比磷酸钙法高 5-100 倍。 ◆ 能够把ＤＮＡ和ＲＮＡ转染到各种细胞。 ◆ 转染的稳定性好，可重复性高。 5、病毒介导的转染 ❖ 优点：整和效率高, 可使外源基因在宿主细胞中长期表达。 ❖ 缺点：存在潜在的安全危险性。 （四） 影响细胞转染效率的主要因素 1、细胞培养物 ➢ 健康的细胞培养物是成功转染的基础。 ➢ 不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。 ➢ 高的转染效率需要一定的细胞密度。一般推荐在转染前24 小时将细胞传代， 这样可提供正常细胞代谢，增加对外源 DNA 摄入的可能。 2、血清 ◆ 血清质量的变化直接影响转染效率。 ◆ 脂质体转染在有血清存在情况下效率较低，因为血清会影响复合物的形成。 ◆ 有些对血清敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡，导致转染效率 极低
(教案续页) 辅助手段和 基本内容 时间分配 3、载体构建 ÷转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA、RNA、PCR产物、寡核苷酸 等)也影响转染结果。 冬同时做空载体对照可排除毒性影响的干扰。 4、DNA质量 ÷DNA质量对转染效率影响非常大(0D260/OD280)。 冬一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DM不纯， 带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有 效形成及转染的进行。 5、转染技术 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DA与转染 试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。 (五)细胞转染注意事项 1、如为贴壁生长的细胞，最好在转染前一日接种细胞，转染当日的细胞密度 以70-90%（贴壁细胞）或2×106一4×10细胞/m1(悬浮细胞)为 宜，最好在转染前4小时换一次新鲜培养液。 2、用于转染的质粒DNM必须无蛋白质，无RNA和其它化学物质的污染， 0D260/280比值应在1.8左右。（若>1.9，表明有NA污染；若<1.6，表明有蛋 白质、酚等污染)。 3、在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因 为血清会影响复合物的形成。 4、阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在 转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 5、抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素 一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素 可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。所以，在转染培养 基中不能使用抗生素。 6、一般在转染后24-48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的， 24-48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验
（教案续页） 基 本 内 容 辅助手段和 时间分配 ３、载体构建 ❖ 转染载体的构建（病毒载体，质粒 DNA、RNA、PCR 产物、寡核苷酸 等）也影响转染结果。 ❖ 同时做空载体对照可排除毒性影响的干扰。 ４、DNA 质量 ❖ DNA 质量对转染效率影响非常大（OD260/OD280）。 ❖ 一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯， 带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有 效形成及转染的进行。 ５、转染技术 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转染 试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。 （五）细胞转染注意事项 1、如为贴壁生长的细胞，最好在转染前一日接种细胞，转染当日的细胞密度 以 70-90%（贴壁细胞）或２×１０６－４×１０６细胞／ｍｌ（悬浮细胞 ）为 宜，最好在转染前 4 小时换一次新鲜培养液。 2、用于转染的质粒 DNA 必须无蛋白质，无 RNA 和其它化学物质的污染， OD260/280 比值应在 1.8 左右。(若>1.9，表明有 RNA 污染; 若<1.6，表明有蛋 白质、酚等污染）。 3、在开始准备 DNA 和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因 为血清会影响复合物的形成。 4、阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在 转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 5、抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素 一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素 可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。所以，在转染培养 基中不能使用抗生素。 6、一般在转染后 24-48 小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的， 24-48 小时后即可进行靶基因表达的检测等实验
(教案续页) 辅助手段和时 基本内容 间分配 第二节、RNA干扰技术 (一)RNA干扰的概念 RNA干扰(RNA interference,简称RNAi):是正常生物体内抑制特定基因表达 的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNAs时， 该mRWA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它发生在转录后水平，又称为转 录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。 (二)RNA干扰的机制 dsRNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA),这些siRN A与同源的靶NA互补结合，特异性酶降解靶RNA,从而抑制、下调相应基因的 表达。 (三)RNA干扰的应用 RNAi主要通过在转录后(post-transcriptional)水平阻断基因的表达， 导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。 冬比如，我们可以按拟定的方式来关闭(shutting off)非必需或致病基因的 功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。 RNAi临床治疗的前景有赖于疾病的发生发展与特定基因的关系研究。 课后小结及课堂讨论等师生互动环节： 课后小结： 1.医学分子生物学主要研究人体生物大分子（基因，蛋白质）和大分子体系的 结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。 2.与生殖相关的分子生物学技术主要包括转染技术、PCR技术、RNA千扰技术、 DNA序列分析技术、Souther印迹技术、Northern印迹技术、Western印迹技 术、免疫组织化学技术等。 课堂讨论： 1.与生殖相关的分子生物学技术主要包括哪些？ 2.影响细胞转染效率的主要因素是什么？
（教案续页） 基 本 内 容 辅助手段和时 间分配 第二节、RNA 干扰技术 （一）RNA 干扰的概念 RNA 干扰（RNA interference ,简称 RNAi）：是正常生物体内抑制特定基因表达 的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNAs 时， 该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默的现象，它发生在转录后水平，又称为转 录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS)。 （二）RNA 干扰的机制 dsRNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），这些ｓｉＲＮ Ａ与同源的靶 RNA 互补结合, 特异性酶降解靶 RNA，从而抑制、下调相应基因的 表达。 （三）RNA 干扰的应用 ❖ RNAi 主要通过在转录后（post-transcriptional）水平阻断基因的表达， 导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。 ❖ 比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shutting off）非必需或致病基因的 功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。 ❖ RNAi 临床治疗的前景有赖于疾病的发生发展与特定基因的关系研究。 课后小结及课堂讨论等师生互动环节： 课后小结： 1. 医学分子生物学主要研究人体生物大分子（基因，蛋白质）和大分子体系的 结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。 2. 与生殖相关的分子生物学技术主要包括转染技术、PCR 技术、RNA 干扰技术、 DNA 序列分析技术、Souther 印迹技术、Northern 印迹技术、Western 印迹技 术、免疫组织化学技术等。 课堂讨论： 1. 与生殖相关的分子生物学技术主要包括哪些？ 2. 影响细胞转染效率的主要因素是什么？
(教案末页) 通过这两节的学习，应熟练掌握转染技术的基本概念以 及几种转染方式的优缺点：熟练掌握影响细胞转染效率的各 总结 种因素和细胞转染注意事项；了解NA干扰技术的概念： 了解RNA干扰技术的机制：了解RNA干扰技术的应用。 这两节的学习为以后科研课题的顺利开展奠定了基础。 1.与生殖相关的分子生物学技术主要包括哪些？ 2.影响细胞转染效率的主要因素是什么？ 复习思考题 3.细胞转染过程中有哪些注意事项？ 4.RNA干扰技术的概念？ 教学内容充实，逻辑结构安排合理。教学深度适中，时间安 实施情况及分析 排合理，理论和临床结合恰当
（教案末页） 总结 通过这两节的学习，应熟练掌握转染技术的基本概念以 及几种转染方式的优缺点；熟练掌握影响细胞转染效率的各 种因素和细胞转染注意事项；了解 RNA 干扰技术的概念； 了解 RNA 干扰技术的机制；了解 RNA 干扰技术的应用。 这两节的学习为以后科研课题的顺利开展奠定了基础。 复习思考题 1. 与生殖相关的分子生物学技术主要包括哪些？ 2. 影响细胞转染效率的主要因素是什么？ 3. 细胞转染过程中有哪些注意事项？ 4. RNA 干扰技术的概念？ 实施情况及分析 教学内容充实，逻辑结构安排合理。教学深度适中，时间安 排合理，理论和临床结合恰当