及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1% 的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5 mol/L Tris-CI(pH8.0)和0.1molL Tris-Cl(pH80)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到76以上,因为酸性 条件下DNA会分配于有机相。 11.氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积 体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀 性,操作时应戴手套 12.TE缓冲液:10 mmo/L Tris-Cl(pH80),1 mmO/L EDTA(pH80)。高压 灭菌后储存于4℃冰箱中。 13. STET: 0.1 mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0), 10 mmoVL EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100. 14.STE: 0.1mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0), Immol/L EDTA(pH8.0)o 15.电泳所用试剂:(1)TBE缓冲液(5×):称取Ti54g,硼酸27.5g, 并加入0.5 MEDTA(pH80)20m,定溶至1000m。(2)上样缓冲液(6×) 0.25%溴酚蓝,40%(w/)蔗糖水溶液。 16.溴化乙锭:水中加入溴化乙啶,搅拌数小时至溶解。将配好的10mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中,室温保存,使用时稀释至0.5μg/ml。 7.溶液I:pH8.0GET缓冲液(50mmol葡萄糖,l0 mmol/EDTA,25 mmol/L Tris-HCl):溶液Ⅰ可成批配制,在(6895×104Pa)高压下蒸气灭菌15min,贮 存于4℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部,增 加溶液的粘度,维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDIA是Ca 和Mg2等二价金属离子的螯合剂,在溶液I中加入EDTA,是要把大肠杆菌 细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制 DNase;对DNA的降解和抑制 微生物生长的作用。 18.溶液Ⅱ:0.2mol/ L Naoh(内含1%的SDS),这个用的时候需现配。要 新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最 佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会在瞬间溶 解,这是由于细胞膜发生了从 bilayer(双层膜)结构向 micelle(微囊)结构的 相变化。用不新鲜的0.4 N NaoH,即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS 是离子型表面活性剂。它主要作用是:a溶解细胞膜上的脂质与蛋白,从而破坏及导致 RNA 和 DNA 的交联，应在 160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入 0.1％ 的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/L Tris-Cl（pH8.0）和0.1mol/L Tris-Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上，因为酸性 条件下 DNA 会分配于有机相。 11. 氯仿：按氯仿:异戊醇=24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/ 体积=1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀 性，操作时应戴手套。 12. TE 缓冲液：10 mmo/L Tris-Cl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。高压 灭菌后储存于 4℃冰箱中。 13. STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA （pH8.0），5% Triton X-100。 14. STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。 15. 电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g， 并加入 0.5M EDTA （pH8.0）20ml，定溶至 1000ml。（2）上样缓冲液（6×）： 0.25% 溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。 16. 溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的 10mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至 0.5μg/ml。 17. 溶液Ｉ：pH8.0 GET 缓冲液（50mmol 葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌 15min，贮 存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增 加溶液的粘度，维持渗透压及防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA 是 Ca2 ＋ 和 Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I 中加入 EDTA，是要把大肠杆菌 细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制 DNase; 对 DNA 的降解和抑制 微生物生长的作用。 18. 溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（内含 1%的 SDS），这个用的时候需现配。要 新配置溶液Ⅱ是为了避免 NaOH 接触空气中的 CO2 而减弱了碱性。NaOH 是最 佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶 解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的 相变化。用不新鲜的 0.4N NaOH，即便有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌。SDS 是离子型表面活性剂。它主要作用是：a.溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏