5.不同末端的插入片段和载体，重组的成功率不同。 当载体两端为粘端而序列互补时，或互为钝端时，载体便有 可能自身环化，而自身环化是重组失败最常见的现象。因此， 为提高重组的成功率，可以选择适当的酶，切开质粒和插入 片段，造成一侧为钝端、一侧为粘端，或两侧粘端的序列不 能互补，或两侧粘端3’、5’伸出不一致；甚至修饰插入片 段，比如先补平插入片段两端，再选择插入片段一端独具的 限制性内切酶处理，使之一端为平头（钝端)，另一端为粘 端，等等。这样的处理可以提高重组的成功率。 6.质粒的5’去磷酸化。质粒酶切两端可以采用Ca|f intestinal alka|ine phosphatase(ClAP,小牛肠碱性磷 酸酯酶)去磷酸化。方法是在酶切质粒之后，直接在反应体 积中加入1个单位的CIAP,混匀，温浴5分钟。具体温度 为：质粒切口5’端凹陷进去的和钝端的用50℃；质粒切口 5’端突出的用37℃