实验25 重组质粒
目的 1.放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报 道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插入到相应的载 体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩 增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等 多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研 究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术 和载体重组技术，鉴于PC技术受到酶的性能和方法学等 多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有 困难，所以载体重组技术倍受青睐
2.DDPCR产物的克隆和测序。 3.RACE PCR产物的克隆和测序。 4.构建基因库、cDNA库，等。 5.纯化基因片段 关于载体一 质粒 质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体 中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗 传单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种 特性：
1.含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片 段。 2.对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导 入细菌。 3.选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一 旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵 抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。 4.在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC 的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因 此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。 本实验所用的质粒是pUC19,全长2686个碱基对 (bp),在质粒的10-110bp段为多克隆位点区域，含有 PstI、EcoR I、KpnI、SmaI、Hind I11、BamH I、Sac !等多种限制性内切酶的位点
EC001092674PHo46 BstAPI 179 Aatll 2617 Ndel 183 Sspl 2501 Ehel 235 Pdml 2294 Bcgl 2215 2486 146/ 236 MCS Scal 2177 lacZ 469. pUC18/19 BsaXI 659 Sapl 683 2686bp 852. Aflll,Pscl 806 Gsul 1784 1626 Cfr10l1779 1466 Ec03111766 Eam11051694, ep (pMB1) BseYl 1110 Cail 1217
pON-1MC5 reading frame1非· 常用载体 ens话amre时 面A工安g4因底单心A44 1、质粒 p0NB2 MCS (reading有am82头” PDNR-1.23 面山比（宜A或ET匹C立.电妙G1A5A 2、λ噬菌体 DN情-3 MCS irading frame3款· 3、哺乳动物 4些元5A上AA政的4AT点GAA 可 细胞载体 B-Galactosidase. 4、酵母载体 0 pug a 950 ImW ss'sIn 的sg83始总8 5、穿梭载体 8 房三关 cd857(nin月 FiGURE 2 Map of the Uni-ZAD XR insertion vector
常 用 载 体 1、质粒 2、λ噬菌体 3、哺乳动物 细胞载体 4、酵母载体 5、穿梭载体
半乳糖苷酶的蓝/白斑 筛选系统 Unpurified PCR product Ligate into pT-Adv 在质粒中含有LacZ基因的 a-肽的序列，当无外源DNA片段 插入时，质粒表达α-肽，它与 Col El 宿主菌的Lac ZM15基因的产物互 pT-Adv on 补，产生有活性的B-半乳糖苷 3.9kb Kan 酶，在含有指示剂X-ga|和诱导 剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝 Transform TOP10F cells plate on 色（质粒自身环化）；外源基因 LB/X-gal/PTG with amp or kan 插入后，肽基因阅读框架被破坏 细菌内无半乳糖苷酶活性存在 菌落呈白色（阳性克隆）
半乳糖苷酶的蓝/白斑 筛选系统 在质粒中含有LacZ基因的 α-肽的序列，当无外源DNA片段 插入时，质粒表达α-肽，它与 宿主菌的Lac ZM15基因的产物互 补，产生有活性的β-半乳糖苷 酶，在含有指示剂X-gal和诱导 剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝 色（质粒自身环化）；外源基因 插入后，肽基因阅读框架被破坏 ，细菌内无半乳糖苷酶活性存在 ，菌落呈白色（阳性克隆）
原 理 采用由Hind I1I切割开的pUC19质粒，以及由Hind III切割PCR片段，用T4噬菌体DNA连接酶将PCR片段 与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子， 即把目的基因DNA插入质粒DNA,实现质粒重组
三种不同的酶切方式 EcoR I ↓ 5'..GAATTC..3'→ 5'..G AATTC...3' 3'...CTTAAG...5' 3.. CTTAA G...5 Pst I ↓ 5'..CTGCAG...3'→ 5'...CTGCA G..3 3'...GACGTC...5' 3..G ACGTC...5' Sma I ↓ 5'...CCCGGG...3'→ 5'...CC0 GGG...3' 3'...GGGCCC..5' 3'...GGG CCC..5
实准备 (参考教材)