目的 观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链 式反应(RTPCR)以其灵敏度高,要求样品量少,实验周期 短而倍受青睐。有人将RTPCR实验结果与Northern blot 结果等进行比较分析,发现两种不同方法所得到的实验结 果相一致。 类似的有Northern blot、原位杂交,甚至原位PCR 等
原理 首先,以目的基因mRNA为模板,利用反转录酶的活 性,合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的基因特异 引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠Tag DNA 聚合酶的酶促反应,通过变性、退火、延伸的反复循环中, 扩增出大量特异的目的DNA产物。最后,扩增产物通过琼 脂糖凝胶电泳分离,显色,并进行图象分析
实验步骤 1.分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各样品总RNA取5ul加入1ml水中测0D值,当 0D26/0D20≥1.8时,方可使用。根据以下公式计算RNA的浓 度: 样品总RNA含量(ug/ul)=0D20×稀释倍数X40/1000
2.反转录 水 7ul dNTP (each 10mM) 2ul 5Xbuffer 4ul DTT (100mM) 1ul RNAsin (40U/ul) 1ul 随机引物(100uM) 1ul 组织总RNA 2ul 65℃5min,快速插入冰水中,冰上加入: RNAsin (40U/ul) 1ul M-MLV反转录酶(200U/ul)1ul 37C60min,65℃5min(灭活逆转录酶)。-20C保存
3.PCR扩增 水 20ul dNTP (each 0.5mM) 4ul 10Xbuffer 4u1 MgCl2 (25mM) 4ul 上游引物(4uM) 2ul 下游引物(4uM) 2ul 反转录产物 4ul Tag DNA聚合酶(5U/ul) 0.4ul 石腊油 25u| PCR反应条件为94℃3min; 94C40s,55C1min,72C1min,30个循环; 72℃5min→4℃保存