课程总结和 部分新技术介绍
一、中医药对基因组作用的研究 实验1基因组DNA提取(方法类似于RNA的提取) 实验2 Southern blot(方法类似于Northern blot)
实验3PCR PCR是Polymerase chain reaction的缩写,中文译作聚 合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将 微量DNA(含由微量RNA反转录成的cDNA)扩增达10 倍,得到ug级的DNA!该技术发明于八十年代中期,到 了八十年代末,由于引用了耐热DNA聚合酶,使这一技术 得以蓬勃发展,成为分子生物学中应用最为广泛的技术之 一,发挥着日益重要的作用。 由于其方便快捷,在中医药实验研究和临床检测中应 用十分广泛。例如观察慢性炎症的活检组织中一些与肿瘤 发生的基因是否存在突变,中医药治疗后防突变的作用如 何(如同一患者气管脱落细胞与血细胞比较);一些与肿瘤 发生、转归、转移、调亡等基因是否突变、缺失,中医药 的保护与修复如何;以及探针的扩增等等
原理 采用两段引物,分别与DNA两条链上各一段序列 互补,位于模板DNA中拟扩增片段两条链的3'端。加热 使模板DNA变性解链,当反应的温度下降时,两引物分 别与模板DNA两条链发生退火,然后两引物在DNA聚 合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4 种dNTP的反应体中,位于两段引物间的DNA在反复的 变性、退火、延伸的循环里,每一轮扩增的产物再一次充 当下一轮扩增的模板,使其产物增加一倍。经过30-40个 循环,目的DNA可由原来的lpg扩增到lug。图示如下:
a 双链模板 发性 引物复性 R t恤M0mm.. 延伸 变性 月物复性 0m- 延伸 变性 引物复性 C7K0000 延伸 e 置inmh山
注意事项 PCR的常见问题主要有: 1.没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关试 剂缺乏,循环次数不够,退火温度太高,引物设计不好, 模版不够,模版质量差,变性温度过高或过低,变性时间 过长或过短,链延伸时间过短,Taq酶数量不够或质量不行, Mg过低,dNTP过少,模版C/G过于丰富,等等。 2.PCR产物不纯,见多条条带产物。其主要可能有 循环次数太多,退火温度过低,引物设计不合理,污染等。 其中,引物设计不合理的可能性最大。 3.PCR产物前后一片,拖带。其主要可能有循环次 数太多,退火温度太低,链延伸时间过长,模版质量差, 模版过多,污染,Taq酶数量过多,Mg"过多,等等
还有一些值得注意的问题: 4.关于引物 (1)引物的长度。引物的长度要求不一,如模版是单 一的载体和单一的插入片段,可以选用较短的插入片段两 侧的载体序列作为引物,一些常用载体有现成的引物商品, 可以购买。对于复杂的基因库,或反转录产物,为提高引 物的特异性,建议采用较长的引物。具体可以参见RACE PCR介绍。 (2)引物的CG与AT的比例。可能的话,建议1:1 左右。 (3)引物的计算机设计参见本书RTPCR介绍。 5.关于酶。一些实验反复失败,竟然会与酶的质量问 题有关。因此,我们建议购买那些经常从事PCR实验的实 验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶
6.退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的 方法,可以确定退火温度。但是,时常会碰到两条引物的 Tm值不一致,或PCR反复调整仍不见改善,此时可以考 虑Touch Down PCR的方法,具体参见本书RACE PCR介 绍。 7.CG丰富的DNA模版往往不容易扩增。对此,可 以采用DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE),用量为PCR 反应总容积的1/10。比如将4ul的DMSO加入36ul的PCR 反应液,使总容积达40ul。 8.MgC2。通常PCR buffer中含有MgCL2,但是由于 一些不清楚的原因,有时仍嫌不足,此时可以适当增加 MgCl2的浓度
9.PCR是一种十分灵敏的实验,对操作技巧要求高, 为防止加样误差,建议做复管。同时,同时进行多个反应 时,相同的试剂建议先一道配置,并留有余量,比如Taq 酶、I0×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等,混匀,这 样可以很大程度上避免上样误差。 10.关于电泳参见本书实验29。 I1.关于试管。为提高PCR的质量,以及大批量PCR 反应的操作,目前业已开发出不同的PCR试管。比如为减 少管壁导热的延滞,发展出超薄壁的PCR试管;为满足批 量实验,发展出排状PC试管,等等。我们在实验中先后 使用过一些不同的试管,从操作方便和安全上看仍喜欢采 用0.5ml的试管。这样的试管比较结实,不宜引起试管的 破裂和同位素的泄漏,且手持起来方便
12.有关实时定量PCR A10.000 ■■■■■■ 1 Hg 100g 10ng 1ng 左上:实时定量 100p9 10p9 PCR仪 =1g 1.000 右上:该仪的部 分工作原理 0 下:实验结果的 0246810121416182022242828303234303840424446 Cycle 输出
12.有关实时定量PCR