实验29 酶切重组质粒 电泳分离所插入的DNA
目的 1.鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒， 或仅含有自身环化的质粒。当酶切产物电泳后，重组成功 者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带，一条为线性质 粒载体的DNA,分子量大，在后面，另一条为插入的目的基 因，分子量小，在前面；而自身环化者仅有一条载体的DNA 条带。 2.收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因分 开，便于分别回收载体和已大量扩增了的插入目的基因。 比如探针用片段
本实验由2个部分组成 1)酶切重组质粒； 2)DNA的琼脂糖凝胶电泳。 关于限制性内切酶 本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常 用的工具酶。通常不同的限制性内切酶分别能识别一小 段双链DNA序列，长度多在4-6个核苷酸，且呈双重对 称的DNA序列，并将其切断。有粘端和钝端两种形式：
EcoR I ↓ 5'..GAATTC...3'→ 5..G AATTC...3' 3...CTTAAG...5' 3'...CTTAA G..5 Pst I ↓ 5'..CTGCAG..3'→ 5'...CTGCA G...3 3'...GACGTC...5' 3..G ACGTC...5' Sma I ↓ 5..CCCGGG...3→ 5...CCC GGG...3' 3'...GGGCCC...5' 3'...GGG CCC...5
利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA 片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与 插入DNA的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特 性、识别位点等可以参考不同公司的试剂目录。 invitrogen BioDirec CLONTECE 8哭
琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广 泛的技术，该技术利用DNA分子在电场下向电场一极迁 徙的特性。在pH中性的条件下，DNA分子由阴极向阳极 迁徙。其间，DNA分子量大，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙 中迁徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，迁徙快，在电泳 一定时间后，大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。 同样分子量的DNA,环状的较线性的迁徙速度快。分离的 DNA可以方便地用溴乙锭染色，方法是1)在灌胶时直接 把溴乙锭混入凝胶，或2)电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液 (我们推荐前者)，染色后在紫外透射灯下可以看到橘红 色的DNA条带，在一般实验室最低分辨能力（肉眼可见 的)约为50-100ng
原理 采用限制性内切酶Hind III切开插入DNA与质粒载 体，将这一反应液上样于琼脂糖凝胶，电泳，使分子量小 的插入DNA前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载 体DNA分开
实验准备 (参考教材)
实验步骤 1.酶切质粒 取一洁净的l.5 ml Eppendorf管，编好号，插入冰中， 依次加入： 水 7ul 10×缓冲液 2ul BSA 2ul 重组质粒 8ul Hind III lul 20ul 盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置37℃水浴中 温育1小时
2.灌胶 将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳 子。将模放于水平台上。 取一烧杯，放入： 琼脂糖 0.7g 5×TBE 10 ml 水 40 ml 50 ml 混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5u 饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去 表面小泡。待冷却成胶。 如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔 梳子时将凝胶底部拔穿