实验27 阳性单菌落扩增与 小量DNA制备
目的 1.为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA 排除自身环化。鉴定方法主要有: (1)PCR法。采用载体两端的引物进行PCR,一旦插入 成功,则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小 致的PCR产物。 (2)Southern blot法。将培养皿上的菌落转移到硝酸 纤维素膜上,变性、固定,以插入片段为探针作Southern bIot。重组成功者,在相应的菌落位置上可以见到放射自 显影的黑点,培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 (3)酶切鉴定法
2.提供一定数量的DNA以满足一些实验 比如: (1)测序; (2)准备杂交用的探针。 这是该实验的两个主要目的
原理 挑选单一菌落,培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆 菌,用碱性液裂解细菌,再经酸性溶液处理形成钾-SDS 蛋白质-膜复合物,离心后,此复合物与细菌染色体DNA、 高分子量的RNA等得到沉淀,而细菌中小分子量的质粒 DNA将溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后,得到质粒DNA
实验准备 (参考教材)
实验步骤 1.第一天(通常为下午) 从琼脂平板上挑取单一菌落,接种到Fa|con管内的 5mlLB培养液(含氨卞青霉素或相应的抗生素)中。放入 37C恒温摇床中,225-250rpm剧烈摇晃培养过夜(0/N), 扩增大肠杆菌
2.第二天(通常上午开始) (1)吸取1.5ml培养液,移入Eppendorf管中,台式 离心机室温下1.4万转离心2分钟,弃上清,重复一至二次, 以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱
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(2)弃上清,加入100ul溶液1,盖 上盖,剧烈震荡(可以将管底抵于试管架 面上,划15下),充分浮悬细胞沉淀,置 -20°C冰箱内5分钟。 (3)自冰箱中取出试管,加入200u1 溶液11,轻轻颠倒混匀,放于冰上5分钟 (4)加入150u溶液111,轻轻颠倒混匀,放于冰上 15分钟。 (5)放入台式离心机,室温下1.4万转离心3分钟, 将上清移入一新的Eppendorf管,加入1ml100%乙醇,混 匀,放入-20℃冰箱5分钟。 (6)自冰箱中取出试管,迅速移入4C环境下的台式 离心机,1.4万转离心5分钟,小心弃去上清,倒置试管于 纸巾上流尽乙醇