实验26 质粒转化大肠杆菌
目的 1.重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的 重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把 重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗 性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自身环 化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗 相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传 代。不然，假如重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素 而死亡
2.为扩增质粒和其它载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需 要20-30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到 几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可 以在短时内极大地扩增目的质粒。 *作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过 的工程菌
原理 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受 态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些 插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×10-2X10'个转 化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆 菌的表面，在42C的温度时，大肠杆菌出现热休克，质 粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随 后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并 且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化 成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌 落
实验淮备 (参考教材)
实验结果 转化成功，培养皿中可见散在的菌落，其中加入100ul 培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养皿的一 倍。 转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后 者提示可能是抗生素浓度不够或失效
实验步骤 自-70°C冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶 解约5-15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并 立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 50 ul DNA 5ul 轻轻混匀，静置冰上30分钟。 于42°℃水浴中热休克细菌45-60秒，迅速移入湿冰 中，静置2分钟，加入900ulLB培养液，放入37C恒温 箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul 涂于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒 置，存放于37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落
1.无菌落，失败。 或培养条件不充 分。 5s 2.菌落布满如苔 样，失败，可能 是抗生素浓度不 够或失效。 古接 3.菌落布满，浓 02/2 D0a9 度太高，失败。 加P 4.出现菌落，符 合要求
注意事项 1.本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而 采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环 素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。 2.整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂 板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通 实验台上操作。 3.接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后 方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议 采用成L型的自制玻璃涂棒，这样由于L型的下端与琼脂板 的接触面大，不易将琼脂板划破
4.培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等， 倒置放入培养箱。 5.感受态大肠杆菌的制备： (1)在无污染的条件下，用LB扩增大肠杆菌，并离心 收集。 (2)4C条件下，用0.1mo1/L CaCl2重悬沉淀，再离 心沉淀，以洗去LB培养液。 (3)4C条件下，用0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，分装 备用。大约50ml的LB培养液的大肠杆菌，溶于2ml的CaCl2 中（每mlLB培养液大约含10°成活的大肠杆菌，LB培养的 菌落要求划皿约16-20小时的菌落)