目的 1.重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其它载体重组后,通常会发生质粒的 重组失败,包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选,把 重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗 性基因,一旦重组成功,或者不含插入片段的质粒自身环 化,抗生素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抵抗 相应抗生素的能力,可以在含该抗生素的培养基上生长传 代。不然,假如重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素 而死亡
2.为扩增质粒和其它载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代仅需 要20-30分钟,而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到 几百个拷贝。因此,通过对转化成功的大肠杆菌培养,可 以在短时内极大地扩增目的质粒。 *作为分子生物学用大肠杆菌,是经过实验室改造过 的工程菌
原理 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受 态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些 插入目的DNA片段的重组质粒,产生5×10-2X10'个转 化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆 菌的表面,在42C的温度时,大肠杆菌出现热休克,质 粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随 后,加入LB培养液,于37℃振动培养可使细菌复苏,并 且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效率。转化 成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌 落
实验结果 转化成功,培养皿中可见散在的菌落,其中加入100ul 培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养皿的一 倍。 转化失败,培养皿上无菌落,或菌落布满如苔样,后 者提示可能是抗生素浓度不够或失效
实验步骤 自-70°C冰箱中取出受感态大肠杆菌,插入湿冰中溶 解约5-15分钟,轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管,并 立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 50 ul DNA 5ul 轻轻混匀,静置冰上30分钟。 于42°℃水浴中热休克细菌45-60秒,迅速移入湿冰 中,静置2分钟,加入900ulLB培养液,放入37C恒温 箱摇床,225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul 涂于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上,待干燥后,倒 置,存放于37℃的培养箱中过夜。 次日,检查各培养皿中是否出现菌落
1.无菌落,失败。 或培养条件不充 分。 5s 2.菌落布满如苔 样,失败,可能 是抗生素浓度不 够或失效。 古接 3.菌落布满,浓 02/2 D0a9 度太高,失败。 加P 4.出现菌落,符 合要求