实验8 Northern blot
目的 1.定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转 录的水平。 2.比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的 差异。 3.比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的 差异
由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多 年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时反映 某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。在中医药实 验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转 录的调控作用。例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白等研究。 通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的 和核酸水平的。两者的含量变化均与其生成、代谢有关， 而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等 因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的， 所以对Northern blot的结果要有客观的分析。 类似目的的实验主要为RTPCR
原理 采用变性凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝 胶之中。应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜，烘 干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记 的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同 位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于 相应分子量mRNA的条带。最后，对条带进行光密度扫描， 并统计分析
实验准备 (参考教材)
实验步骤 1.RNA电泳 取10 ug RNA旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品缓 冲液。置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却， 再加4u1上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注入电泳 缓冲液1×MOPS,浸没凝胶，轻轻拔去疏子。接通电源，负 极靠近上样孔。吸取样品24u,注入上样孔内。开启电源， 电压调至100V。电泳约2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关 闭电源。 轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳 结果。在凝胶一侧放把尺，拍照
2.RNA转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器，注入20×SSC,容器上缘架一水平玻 璃板。取2-4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两 侧浸入20×S$C中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤 纸间及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔及以上部分， 在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上 放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤 维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸 水中，再浸于20×S$C中，取出平放于凝胶之上，缺角处与 凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气 泡。膜上置2-4层20×SSC浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸 与硝酸纤维素膜间的气泡
用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻 璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的 缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺4-6厘米厚的卫生 纸，上置一平玻板，玻板上压一300-500克的重物。过 夜。 次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在投射紫 外灯仪上确认RNA已全部转移至硝酸纤维素膜上。把该 膜夹于两张洁净的滤纸间，在80℃真空干燥箱中真空 干燥两小时
纸的 重物 一酸璃板 萨后折地素景 成足发磁 e国进照 Whatman 3M 转移磁冲流 +一程酸 支料物
3.探针标记(（此工作与膜转移于同一天进行。) 水 14 ul OLB 5 ul BSA (10mg/ml 1ul DNA 30-50 ng 2 ul 100C×5min,37C×10min,4C×5min a [P]dCTP (50uCi) 2.5ul 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5ul 混匀，4℃过夜，次日再加 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5ul 半小时后加入终止液 50 ul