管中，37℃振荡培养过夜。 2.取0.5mL菌液转接到一个含有50mLLB培养液锥形瓶中，37℃振荡 培养2-3小时。使细胞进入对数生长期。(0D600=0.4-0.5,这为实验成功 的关键)。 3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10分钟。 4.4℃4000rpm离心10分钟，回收细胞。 5.倒出培养液，将离心管倒置以便培养液流尽 6.用冰冷的0.1 mol/LCaCl10mL悬浮细胞，冰上放置30分钟。 7.4℃4,000rpm离心10分钟，回收细胞。 8.用冰冷的0.1 mol/LCaCl2mL悬浮细胞，冰上操作。 9.新鲜的感受态细胞在424小时之内可直接用于转化，也可加入总体 积15%的无菌甘油混匀后分装成小管，置于70℃可保存6个月，转化效率 基本不变。 注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装 上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温 冰箱内。 （二)转化： 1.新鲜制备的或70℃下保存的100μL感受态细胞，置于冰上，完全 解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2.加入5L质粒DNA,DNA浓度为1OpgL,轻轻混匀。 同时做两个对照： 对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同 此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现. 对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5知！菌 液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 3.冰上放置30分钟 4.42℃水浴热激90秒。 5.冰上放置2分钟。 6.加400uLB培养液，37℃250rpm振荡培养45分钟。 7.室温下4.000pm离心5分钟，用枪头吸掉400uL上清液，用剩余 的培养液将细胞悬浮。 8.将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上 9.平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平 皿倒置，培养过夜。20 管中，37℃振荡培养过夜。 2．取 0.5mL 菌液转接到一个含有 50mL LB 培养液锥形瓶中，37℃振荡 培养 2-3 小时。使细胞进入对数生长期。 ( OD600=0.4-0.5，这为实验成功 的关键)。 3．将菌液转移到 50mL 离心管中，冰上放置 10 分钟。 4. 4℃ 4 000rpm 离心 10 分钟，回收细胞。 5．倒出培养液，将离心管倒置以便培养液流尽。 6. 用冰冷的 0.1mol/L CaCl2 10mL 悬浮细胞，冰上放置 30 分钟。 7. 4℃ 4,000rpm 离心 10 分钟，回收细胞。 8. 用冰冷的 0.1mol/L CaCl2 2mL 悬浮细胞，冰上操作。 9. 新鲜的感受态细胞在 4~24 小时之内可直接用于转化，也可加入总体 积 15%的无菌甘油混匀后分装成小管，置于-70℃可保存 6 个月，转化效率 基本不变。 注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装 上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温 冰箱内。 （二）转化： 1．新鲜制备的或-70℃下保存的 100μL 感受态细胞，置于冰上，完全 解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入 5μL 质粒 DNA，DNA 浓度为 10pg/μL，轻轻混匀。 同时做两个对照: 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上面相同. 此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现. 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5μl 菌 液涂布于不含抗生素的 LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落. 3．冰上放置 30 分钟。 4．42℃水浴热激 90 秒。 5．冰上放置 2 分钟。 6．加 400μLB 培养液，37℃ 250rpm 振荡培养 45 分钟。 7．室温下 4,000rpm 离心 5 分钟，用枪头吸掉 400μL 上清液，用剩余 的培养液将细胞悬浮。 8．将细菌涂布在 Amp/LB 琼脂平板上。 9．平皿在 37℃下正向放置 1 小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平 皿倒置，培养过夜