实验七大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 一、实验目的 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术。 2. 掌握转化的方法和技术。 二、实验原理 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或 以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。在0℃下的CC2低渗溶液中， 细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的 经基一钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42C短时间热处理（热 休克)，可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性 培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp抗性） 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜， 即可得到转化菌落。 三、实验用品 (一)仪器：低温离心机、恒温摇床、恒温箱、-70℃冰箱、恒温水浴器 (二)试剂 1.氨苄青霉素 2.大肠杆菌DH5a 3.质粒DNA 4.LB培养液 在950mL去离子水中加入： 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 8 NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水 至总体积为1L, 121℃湿热灭菌20min。 5.氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰 箱保存。 四、 实验内容与方法 (一)大肠杆菌感受态细胞的制备： 1.从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mLLB培养液的试 19 19 实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 一、 实验目的 1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术。 2. 掌握转化的方法和技术。 二、 实验原理 细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA 或 以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。在 0℃下的 CaCl2 低渗溶液中， 细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的 DNA 形成不易被 DNA 酶所降解的 羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热 休克），可以促进细胞吸收 DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择性 培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如 Amp 抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜， 即可得到转化菌落。 三、 实验用品 (一) 仪器：低温离心机、恒温摇床、恒温箱、-70℃冰箱、恒温水浴器。 (二) 试剂 1．氨苄青霉素 2．大肠杆菌 DH5 3．质粒 DNA 4．LB 培养液 在 950mL 去离子水中加入： 胰蛋白胨 (tryptone) 10g 酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用 Na0H 调节 pH 至 7.0，加入去离子水 至总体积为 1L， 121℃湿热灭菌 20min。 5．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成 100mg／mL 溶液，置-20℃冰 箱保存。 四、 实验内容与方法 （一）大肠杆菌感受态细胞的制备： 1．从大肠杆菌 DH5α平板上挑取一个单菌落接于 2mL LB 培养液的试