本实验通过利用农杆菌介导的叶盘转化法，将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因导入到花椰菜 中，获得转基因植株，从而加强学生的实践动手能力及分析问题和解决问题的能力。本实验 将理论与实践紧密联系起来 ,对激发和培养学生对理论课的学习热情具有促进 实验 综合了MS培养基、B培养基的配制、细菌的培养、植物组织培养、遗传转化等知识 三、材料和方法 (一)实验材料 1、工程菌LBA404 2、 植物材料 花椰菜幼苗 3、培养基LB培养基、MS培养基的各种母液、卡那霉素等 4、实验用具 玻璃试管、培养皿、三角瓶、加样枪、高压消毒锅、超净工作台、培养室 (二)实验方法 1、受体材料准 :甘蓝种子用水漂汾 ,70%乙醇消毒1分钟，0.1%的升汞消毒20 30分钟，无菌水冲洗5遍。播种于无菌0.7%固体琼脂培养基上，阳光下培养6~7天。 2、配制培养基 预培养培养基：MS+HAA0.2mg+BA2.0mg1. 共培养培养基：同上 脱菌培养基 MS+HAA0.2mg+BA20mg+羧苄青素S00mg 筛选培养基：MS+HAA0.2mg/1+BA2.0mg1+羧苄青霉素500mg/1+Km10mg1 生根培养基：1/2MS+1BA0.5+Km10mg/L 抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至50℃左右的培养基中，用力摇匀可将 磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅纫后分装于无菌培养皿中，生 根培养基分装于三角瓶中 农杆菌培养 (1)挑取单菌落，接种于20mlLB+Km25mgM十Rif50mg1液体培养基中，27严C、180rpm 培养过夜。 2)取400g菌液转接入20ml无抗生素的LB液体培养中，继续培养4~6小时 )在超净工作台上，将菌液倒入无菌带盖腐心管内，盖上管盖，用石蜡膜封口，4000pm 离心5分钟 (4)取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无茵MS液体培养基， 悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS液体培养基稀释至OD0≥0.2。 5、叶盘法转化 (1)取培养67天的花椰菜无菌幼苗，将胚轴剪成58mm长的小段，子叶带子叶柄 剪下，转入预培养培养基中，于25℃，光照条件下预培养2天。 (2)将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。 (3)向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃2~一3下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤 纸上吸去多余菌液。 (4)将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，于 27℃，里暗中共培养2天 (5)将材料转入到脱茵培养基中，于26℃， 光照条件下培养6~7天。 (⑥)将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。2一3固有绿芽分化。 (⑦)将绿芽转入筛选培养基，2周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养3~4代，淘汰 白化的及畸型苗。 本实验通过利用农杆菌介导的叶盘转化法，将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因导入到花椰菜 中，获得转基因植株，从而加强学生的实践动手能力及分析问题和解决问题的能力。本实验 将理论与实践紧密联系起来，对激发和培养学生对理论课的学习热情具有促进作用。本实验 综合了 MS 培养基、LB 培养基的配制、细菌的培养、植物组织培养、遗传转化等知识。 三、材料和方法 （一）实验材料 1、 工程菌 LBA4404 2、 植物材料 花椰菜幼苗 3、 培养基 LB 培养基、MS 培养基的各种母液、卡那霉素等 4、 实验用具 玻璃试管、培养皿、三角瓶、加样枪、高压消毒锅、超净工作台、培养室 （二）实验方法 1、受体材料准备：甘蓝种子用水漂洗，70％乙醇消毒 1 分钟，0．1％的升汞消毒 20、 30 分钟，无菌水冲洗 5 遍。播种于无菌 0．7％固体琼脂培养基上，阳光下培养 6～7 天。 2、配制培养基 预培养培养基：MS+IAA0.2mg/l+BA2.0mg/l。 共培养培养基：同上 脱菌培养基：MS+IAA0.2mg/l+BA2.0mg/l +羧苄青霉素 500mg/l 筛选培养基：MS+IAA0.2mg/l+BA2.0mg/l +羧苄青霉素 500mg/l+Km 10mg/l 生根培养基：1／2MS+IBA 0．5+Km 10mg／L 抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至 50℃左右的培养基中，用力摇匀(可将 磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅匀)后分装于无菌培养皿中，生 根培养基分装于三角瓶中。 3、农杆菌培养 (1)挑取单菌落，接种于 20mlLB+Km 25mg/l 十 Rif 50mg/l 液体培养基中，27oC、180rpm 培养过夜。 (2)取 400gl 菌液转接入 20ml 无抗生素的 LB 液体培养中，继续培养 4～6 小时。 (3)在超净工作台上，将菌液倒入无菌带盖离心管内，盖上管盖，用石蜡膜封口，4 000rpm 离心 5 分钟。 (4)取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无菌 MS 液体培养基， 悬浮起菌体，转入无菌容器中，用 MS 液体培养基稀释至 OD600≈0.2。 5、 叶盘法转化 （1）取培养 6～7 天的花椰菜无菌幼苗，将胚轴剪成 5～8mm 长的小段，子叶带子叶柄 剪下，转入预培养培养基中，于 25 oC，光照条件下预培养 2 天。 (2)将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。 (3)向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃 2～3 下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤 纸上吸去多余菌液。 (4)将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，于 27℃，黑暗中共培养 2 天。 (5)将材料转入到脱菌培养基中，于 26 oC，光照条件下培养 6～7 天。 (6)将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。2～3 固有绿芽分化。 (7)将绿芽转入筛选培养基，2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养 3～4 代，淘汰 白化的及畸型苗