剂结合简单的台式离心机就可以分离AAV,见图3。但是化学[4] Watanabe N, Yano K, Tsuyuki K,eta. Re-examination 试剂法一般不单独使用,常常需要配合超速离心、色谱等方 of regulatory opinions in Europe: possible contribution 联合使用。考虑到离心机需反复使用,该方法不利于AAV的 for the approval of the first gene therapy product Glybera 大规模纯化。 U]. Mol Ther Methods Clin Dev, 2015, doi: 10.1038/ 集解口m□水相出分渔衡 CHCl处理 mtm2014.66. 5]刁勇,王启钊,肖卫东,等重组腺相关病毒载体相关性杂 图3化学试剂法分离AAV 质生物工程学报,2011,27(5):717 [6 Xu ZH. Shi CY, Qian QJ Scalable manufacturing method- 3.2超滤法 ologies for improving adeno-associated virus-based phar 超滤法是AAⅤ浓缩的主要方法,经常用于降低溶液体 maprojects[J). Chin Sci Bull, 2014, 59(16): 1 845 积。通常AAV载体的分子质量超过600kDa,这样的生物大分17] Wang Z, Halbert cl,LeeD,eta. Elimination of con 子很容易被截留而实现浓缩,无机盐、水、小分子蛋白等则可 taminating cap genes in AAv vector virions reduces im- 以通过膜孔。据报道,采用分子截留量为100 kDa mwco的 mune responses and improves transgene expression in a 超滤膜,在10~12psi下,可以将AAV样品溶液浓缩130倍,且 无载体损失。该法的优势是:1)分离过程不发生相变,最大可 canine gene therapy model[J]. Gene Ther, 2014, 21(4) 363 能保持载体活性:2)适用于GMP条件下规模化纯化,在封闭系[8]QuG, Bahr-Davidson. J, Prado J, et al. Separation of ade- no-associated virus type 2 empty particles from genome 与色谱、超速离心法等纯化方法相结合。此外,膜污染也是超 containing vectors by anion-exchange column chromatog- 滤方法不可回避的问题。 raphy [J]. J Virol Methods, 2007, 140(1/2): 183 4结语 [9 Ayuso E, Mingozzi F, Montane J, et al. High AAV vector 在AAV产品中,残余的宿主细胞蛋白、牛血清蛋白、核酸 purity results in serotype and tissue-independent enhance- 酶或者核酸等杂质,不但会影响转染效果,而且会引起免疫反 ment of transduction efficiency]. Gene Therapy, 2010 应。为了得到较高纯度产品,经常需要将超速离心法、液相 17(4):503 色谱法、化学试剂法和超滤法联合应用,如阳离子交换色谱[10 Strobel B, Miller FD, Rist w, et al. Comparative analy Poros hs二次联用纯化AAV2, Poros hs结合阴离子色谱 sis of cesium chloride- and iodixanol-based pur Q- Sepharose色谱纯化AAV6,获得载体纯度大于90%;CHT recombinant adeno-associated viral(AAV )vectors for pre- 色谱联合阴离子色谱纯化AAV1,获得载体纯度大于95% clinical applications]. Hum Gene Ther Methods, 2015 CHT色谱结合 Poros hs纯化AAV9,获得载体纯度与2次超速 26(4):147 离心方法纯化的结果相当;SP阳离子色谱联合阴离子色谱,[ouW, Wang M,WuY,era!. Scalable downstream strate 获得AAV2、AAV8载体纯度大于98%;甚至,采用CsCl或者 gies for purification of recombinant adeno-associated vi- 碘克沙醇超速离心之后,再用双离子吸收膜和CIM色谱进 rus vectors in light of the properties]. Curr Pharm Bio- 一步分离的AAV等载体的纯度均达到99%。这样的高纯 technol,2015,16(8):684 度,能够满足ANV的临床以及临床前研究所需。载体纯度是12] Segura mm. kamen aa, Garnier A. Overview of current 液相色谱纯化工艺设计的一个主要指标。然而,几种纯化方 scalable methods for purification of viral vectors. Meth 法联合使用时使操作步骤增加,在每一个纯化步骤中,回收率 ods in Molecular Biology, 2011, doi: 10.1007/978-1 般在20%~60%,必然会造成载体的损失。目前,上市 61779-09594 销售的 Glybera注射液,位于“天价”药(5.3万欧元/支)之列,其13]唐思,夏素霞,董晓茜,等 LC-MS/MS法测定人血浆中 中一个重要原因,就是如今AAV载体规模化制备成本高、载体 匹伐他汀代谢物匹伐他汀内酯浓度及其药动学研究 纯化的回收率低下。因此,回收率与纯度如何平衡,一直以来 中国药房,2015,26(2):219 是困扰人们的一个主要问题。随着人们对AAV结构和性质了1 Wong FF,HoML, Yamagami M,etal. Effective gene 解的不断深入,液相色谱技术不失为一种有效途径,可稳定地 delivery to valvular interstitial cells using adeno-associat- 生产出安全、有效、廉价的AAV载体药物,更好地满足临床试 ed virus serotypes 2 and 3]. Tissue Eng Part C Methods 验以及市场需求 2015,21(8):808 参考文献 [15 Summerford C. Samulski RJ. Membrane-associated hepa [1 Lisowski L, Tay SS, Alexander IE. Adeno-associated vi ran sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated rus serotypes for gene therapeutics ] Curr Opin Pharma- virus type 2 virions[].J Virol. 1998. 72(2): 1 438 col,2015,17(24):59 [16 Piedra J, Ontiveros M, Miravet S, et al. Development of [2 Gardner MR, Kattenhorn LM, Kondur HR, et al.AAV-ex a rapid, robust, and universal picogreen-based method to pressed eCD4-lg provides durable protection from multi- titer adeno-associated vectors]. Hum Gene Ther Meth- ple SHiv challenges[J]. Nature, 2015, doi: 10.1038/na- ods,2015,26(1):35 [17 Pechan P, Ardinger J, Ketavarapu J, et al. Aurintricar- [3 Scott LJ. Alipogene tiparvovec: a review of its use in adul boxylic acid increases yield of HsV-1 vectors]. Mol ts with familial lipoprotein lipase deficiency). Drugs Ther Methods Clin Dev 2014. doi: 10.1038/mtm2013.6 2015,75(2):175 [18 Brument N, Morenweiser R. Blouin V, et al. A versatile 1882. China Pharmacy 2015 Vol 26 No 34 中国药房2015年第26卷第34期China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 34 中国药房 2015年第26卷第34期 剂结合简单的台式离心机就可以分离AAV，见图3。但是化学 试剂法一般不单独使用，常常需要配合超速离心、色谱等方法 联合使用。考虑到离心机需反复使用，该方法不利于AAV的 大规模纯化[47] 。 3.2 超滤法 超滤法是 AAV 浓缩的主要方法，经常用于降低溶液体 积。通常AAV载体的分子质量超过 600 kDa，这样的生物大分 子很容易被截留而实现浓缩，无机盐、水、小分子蛋白等则可 以通过膜孔。据报道，采用分子截留量为100 kDa MWCO的 超滤膜，在10～12 psi 下，可以将AAV样品溶液浓缩130倍，且 无载体损失。该法的优势是：1）分离过程不发生相变，最大可 能保持载体活性；2）适用于GMP条件下规模化纯化，在封闭系 统中无菌操作。但是超滤方法一般较少单独使用，通常需要 与色谱、超速离心法等纯化方法相结合。此外，膜污染也是超 滤方法不可回避的问题[11] 。 4 结语 在AAV产品中，残余的宿主细胞蛋白、牛血清蛋白、核酸 酶或者核酸等杂质，不但会影响转染效果，而且会引起免疫反 应[48] 。为了得到较高纯度产品，经常需要将超速离心法、液相 色谱法、化学试剂法和超滤法联合应用，如阳离子交换色谱 Poros HS 二次联用纯化 AAV2，Poros HS 结合阴离子色谱 Q-Sepharose 色谱纯化 AAV6，获得载体纯度大于 90％[8] ；CHT 色谱联合阴离子色谱纯化AAV1，获得载体纯度大于 95％[37] ； CHT色谱结合Poros HS纯化AAV9，获得载体纯度与2次超速 离心方法纯化的结果相当[39] ；SP阳离子色谱联合阴离子色谱， 获得AAV2、AAV8载体纯度大于98％[40] ；甚至，采用CsCl或者 碘克沙醇超速离心之后，再用双离子吸收膜[45] 和CIM色谱进 一步分离的 AAV 等载体的纯度均达到 99％[32] 。这样的高纯 度，能够满足AAV的临床以及临床前研究所需。载体纯度是 液相色谱纯化工艺设计的一个主要指标。然而，几种纯化方 法联合使用时使操作步骤增加，在每一个纯化步骤中，回收率 一般在20％～60％[8，11，37] ，必然会造成载体的损失。目前，上市 销售的Glybera注射液，位于“天价”药（5.3万欧元/支）之列，其 中一个重要原因，就是如今AAV载体规模化制备成本高、载体 纯化的回收率低下。因此，回收率与纯度如何平衡，一直以来 是困扰人们的一个主要问题。随着人们对AAV结构和性质了 解的不断深入，液相色谱技术不失为一种有效途径，可稳定地 生产出安全、有效、廉价的AAV载体药物，更好地满足临床试 验以及市场需求。 参考文献 [ 1 ] Lisowski L，Tay SS，Alexander IE. Adeno-associated vi￾rus serotypes for gene therapeutics [J]. Curr Opin Pharma￾col，2015，17（24）：59. [ 2 ] Gardner MR，Kattenhorn LM，Kondur HR，et al. AAV-ex￾pressed eCD4-Ig provides durable protection from multi￾ple SHIV challenges[J]. Nature，2015，doi：10.1038/na￾ture14264. [ 3 ] Scott LJ. Alipogene tiparvovec：a review of its use in adul￾ts with familial lipoprotein lipase deficiency[J]. Drugs， 2015，75（2）：175. [ 4 ] Watanabe N，Yano K，Tsuyuki K，et al. Re-examination of regulatory opinions in Europe：possible contribution for the approval of the first gene therapy product Glybera [J]. Mol Ther Methods Clin Dev，2015，doi：10.1038/ mtm.2014.66. [ 5 ] 刁勇，王启钊，肖卫东，等.重组腺相关病毒载体相关性杂 质[J].生物工程学报，2011，27（5）：717. [ 6 ] Xu ZH，Shi CY，Qian QJ. Scalable manufacturing method￾ologies for improving adeno-associated virus-based phar￾maprojects[J]. Chin Sci Bull，2014，59（16）：1 845. [ 7 ] Wang Z，Halbert CL，Lee D，et al. Elimination of con￾taminating cap genes in AAV vector virions reduces im￾mune responses and improves transgene expression in a canine gene therapy model[J]. Gene Ther，2014，21（4）： 363. [ 8 ] Qu G，Bahr-Davidson J，Prado J，et al. Separation of ade￾no-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatog￾raphy[J]. J Virol Methods，2007，140（1/2）：183. [ 9 ] Ayuso E，Mingozzi F，Montane J，et al. High AAV vector purity results in serotype and tissue-independent enhance￾ment of transduction efficiency[J]. Gene Therapy，2010， 17（4）：503. [10] Strobel B，Miller FD，Rist W，et al. Comparative analy￾sis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral（AAV）vectors for pre￾clinical applications[J]. Hum Gene Ther Methods，2015， 26（4）：147. [11] Qu W，Wang M，Wu Y，et al. Scalable downstream strate￾gies for purification of recombinant adeno-associated vi￾rus vectors in light of the properties[J]. Curr Pharm Bio￾technol，2015，16（8）：684. [12] Segura MM，Kamen AA，Garnier A. Overview of current scalable methods for purification of viral vectors[J]. Meth￾ods in Molecular Biology，2011，doi：10.1007/978-1- 61779-095-9_4. [13] 唐思，夏素霞，董晓茜，等. LC-MS/MS 法测定人血浆中 匹伐他汀代谢物匹伐他汀内酯浓度及其药动学研究[J]. 中国药房，2015，26（2）：219. [14] Wong FF，Ho ML，Yamagami M，et al. Effective gene delivery to valvular interstitial cells using adeno-associat￾ed virus serotypes 2 and 3[J]. Tissue Eng Part C Methods， 2015，21（8）：808. [15] Summerford C，Samulski RJ. Membrane-associated hepa￾ran sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions[J]. J Virol，1998，72（2）：1 438. [16] Piedra J，Ontiveros M，Miravet S，et al. Development of a rapid，robust，and universal picogreen-based method to titer adeno-associated vectors[J]. Hum Gene Ther Meth￾ods，2015，26（1）：35. [17] Pechan P，Ardinger J，Ketavarapu J，et al. Aurintricar￾boxylic acid increases yield of HSV-1 vectors[J]. Mol Ther Methods Clin Dev，2014，doi：10.1038/mtm.2013.6. [18] Brument N，Morenweiser R，Blouin V，et al. A versatile PEG/（NH4）2SO4 离心分离 细胞裂解液 PEG沉淀 水相 CHCl3处理 图3 化学试剂法分离AAV ·4882·