腺相关病毒载体纯化技术的研究进展 曲伟红1*(1.华侨大学分子药物研究院,福建泉州362021;2九江学院药学与生命科学学院,江西九江 332000 中图分类号R945文献标志码A文章编号1001-0408(2015)34-4880-05 DOl10.6039/ J.Issn.1001-0408.2015.34.41 摘要目的:综述腺相关病毒(AAⅣV)载体的分离纯化方法,为AAⅤ的规模化制备提供参考。方法:以"AAV"" Purity" Chroma- tography”“腺相关病毒”“纯化”等为关键词,组合检索2000年1月-2015年8月在 PubMed、 Web of science、 Elsevier、中国知网、 维普等数据库中有关ANⅤ分离纯化的文献,选择有代表性的文献进行归納、总结,分别从AAV纯化的超速离心法、液相色谱法 化学试剂法和超滤法等4个方面进行综述。结果:共查阅到相关文献260余篇,其中有效文献48篇。液相色谱法纯化AAV表现优 异,亲和色谱、离子交換色谱等色谱技术已经广泛用于AAV1、2、4、5、6、8、9等不同血清型栽体的分离纯化,甚至较难分离的AAV 的空壳栽体也可以实现分离。但是每种血清型载体的理化性质不尽相同,很难用同一种方法纯化所有栽体。结论:液相色谱法 在规模化纯化ANⅤ载体具备良好优势,但是应该根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。 关键词腺相关病毒;超速离心;液相色谱;纯化工艺 AAV载体 相关病毒Ay)(小患分分纯化Ay kb的线 命空AN颗粒 该载体的临床研究已经有100多项,主要用于治疗 Leber's先 天性黑内障、帕金森病、肌营养不良和B型血友病等遗传性疾 病。2012年7月,欧洲药品管理局( European Medicines细胞裂解液G沉淀第一次纯化第二次纯化AN Agency,EMA)批准荷兰 UniQue公司基因药物 Glaber的上 市,该药就是以AAV1为载体,携带LPL基因,用于治疗脂蛋白子,超速离心法能够有效地分离。不足之处是:(1)操作时间 脂酶缺乏症引起的严重的或反复发作的胰腺炎P。该药的上较长,完成2~3次超速离心,需要48~72h,AAV载体长期在 市,更加激发了业界对AAV载体药物的研发热情。因此,不论黏性或者高渗透压(蔗糖或者CsCl)的溶液中及超速离心的强 是药品的商业化供应,还是临床试验都需要大量的病毒载体同。剪切力作用下,可能会导致载体粒子活力降低;(2)要求操作 随着AAV载体药物研究的不断深入,一个重要问题摆在人们人员的技术水平要高若操作不当,则损失严重;(3)在AAV的 面前,就是根据生产质量管理规范( Good manufacturing prac.大规模纯化时,通常需要处理10~200L的细胞裂解液,反复 tices,GMP)要求,规模化生产出能满足临床需要的病毒载体吗。的离心处理,操作烦琐,不利于载体的大规模纯化 笔者以“A" Purity”“ Chromatography”“腺相关病毒”“纯化”2液相色谱法 等为关键词,组合检索2000年1月-2015年8月在 PubMed 目前,色谱技术是AAV规模化纯化的重要方法,也是药物 Web of science、 Elsevier、中国知网、维普等数据库中有关分析检测常用方法。当澄清的病毒液流经固定相时,固定相 AAV分离纯化的文献。结果,共查阅到相关文献260余篇,其的功能区域与AAV衣壳蛋白或者所含有的基因组相互作用, 中有效文献48篇。选择有代表性的文献进行归纳、总结,分别通过改变流动相的组成或者pH值而实现分离。 从AAV纯化的超速离心法、液相色谱法、化学试剂法和超滤法21亲和色谱 等4个方面进行综述,着重阐述了液相色谱法纯化AAV,分别21.1肝素亲和层析在1998年,人们首次发现细胞表面的 介绍了亲和色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱等用于AAV硫酸乙酰肝素糖胺多糖( HSGAG)是一种细胞受体,能够与 的纯化技术,以期为其规模化制备提供参考。 AAV2病毒载体相结合叶。基于肝素亲和层析的结构与硫酸 1超速离心法 肝素蛋白聚糖相似性,建立了肝素亲和层析分离纯化方法,成 超速离心法是最为广泛使用的一种分离方法,根据杂质为AAV2最为普遍使用的纯化方法。但是该方法很难用于 与AAV载体的形状、大小以及等密度点的不同,在高速离心作 以 HSGAG受体以外的其他血清型载体。相似的原理,采用黏 用下实现分离,适用于很多实验室。氯化铯(CsCI)、蔗糖、碘 蛋白结合色谱分离AA4和AAV5,见表1。 克沙醇都可用作超速离心的介质。AAV载体的密度约为1.40 表1分离纯化AAV载体的亲和色谱类型和种类 g/cm,这与存在的一些蛋白质、核酸类杂质有显著不同而实现 色谱类型 血清型 分离"。以CSCl为例,含有ANV的细胞裂解液经过聚乙二醇肝亲和色谱 Poros He、 Hearn agrose (PEG)等沉淀之后,采用CsCl进行超速离心,去除绝大部分杂 免疫亲和色谱 AVB sepharose HP/A20 Mab coupled to AAV1, AAV2. AAV8 2-23 质,经过2次或者3次超速离心,可以获得纯度更高的载体1,生物素亲和色语 HiInp- sparse Monomeric avidin 见图1 固定化金属镍亲和色谱 Ni-nta azam AA2、AW8 该方法的优势是:(1)技术成熟,一般实验室均可操作;黏蛋白亲和色谱 圖 (2)适合所有的血清型载体;(3)对于结构非常相似的空壳粒212免疫亲和层析AAV血清型不同,衣壳蛋白组成结构 ★副教授,博士。研究方向:分子药物与基因治疗。电话:不同,衣壳表面抗原与固定相抗体相互作用,采用这种免疫亲 07928565939。E-mail: honghong2002-2005@163.co 和色谱方法分离AAV。例如,对插入生物素受体肽( Biotin a 1880. China Pharmacy 2015 Vol 26 No 34 中国药房2015年第26卷第34期
China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 34 中国药房 2015年第26卷第34期 ＊副教授，博士。研究方向：分子药物与基因治疗。电话： 0792-8565939。E-mail：honghong2002-2005@163.com 腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，AAV） 是含4.7 kb的线性单链DNA病毒，属于细小病毒家族。目前， 该载体的临床研究已经有100多项，主要用于治疗Leber’s先 天性黑内障、帕金森病、肌营养不良和B型血友病等遗传性疾 病[1-2] 。2012 年 7 月，欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）批准荷兰 UniQure 公司基因药物 Glyber 的上 市，该药就是以AAV1为载体，携带LPL基因，用于治疗脂蛋白 脂酶缺乏症引起的严重的或反复发作的胰腺炎[3-4] 。该药的上 市，更加激发了业界对AAV载体药物的研发热情。因此，不论 是药品的商业化供应，还是临床试验，都需要大量的病毒载体[5] 。 随着AAV载体药物研究的不断深入，一个重要问题摆在人们 面前，就是根据生产质量管理规范（Good Manufacturing Practices，GMP）要求，规模化生产出能满足临床需要的病毒载体[6] 。 笔者以“AAV”“Purity”“Chromatography”“腺相关病毒”“纯化” 等为关键词，组合检索 2000年1月－2015年 8月在 PubMed、 Web of Science、Elsevier、中国知网、维普等数据库中有关 AAV 分离纯化的文献。结果，共查阅到相关文献260余篇，其 中有效文献48篇。选择有代表性的文献进行归纳、总结，分别 从AAV纯化的超速离心法、液相色谱法、化学试剂法和超滤法 等4个方面进行综述，着重阐述了液相色谱法纯化AAV，分别 介绍了亲和色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱等用于AAV 的纯化技术，以期为其规模化制备提供参考。 1 超速离心法 超速离心法是最为广泛使用的一种分离方法，根据杂质 与AAV载体的形状、大小以及等密度点的不同，在高速离心作 用下实现分离，适用于很多实验室[7] 。氯化铯（CsCl）、蔗糖、碘 克沙醇都可用作超速离心的介质。AAV载体的密度约为1.40 g/cm3 ，这与存在的一些蛋白质、核酸类杂质有显著不同而实现 分离[7-8] 。以CsCl为例，含有AAV的细胞裂解液经过聚乙二醇 （PEG）等沉淀之后，采用CsCl进行超速离心，去除绝大部分杂 质，经过2次或者3次超速离心，可以获得纯度更高的载体[9-11] ， 见图1。 该方法的优势是：（1）技术成熟，一般实验室均可操作； （2）适合所有的血清型载体；（3）对于结构非常相似的空壳粒 子，超速离心法能够有效地分离。不足之处是：（1）操作时间 较长，完成2～3次超速离心，需要48～72 h，AAV载体长期在 黏性或者高渗透压（蔗糖或者CsCl）的溶液中及超速离心的强 剪切力作用下，可能会导致载体粒子活力降低；（2）要求操作 人员的技术水平要高，若操作不当，则损失严重；（3）在AAV的 大规模纯化时，通常需要处理10～200 L的细胞裂解液，反复 的离心处理，操作烦琐，不利于载体的大规模纯化[11-12] 。 2 液相色谱法 目前，色谱技术是AAV规模化纯化的重要方法，也是药物 分析检测常用方法[13] 。当澄清的病毒液流经固定相时，固定相 的功能区域与AAV衣壳蛋白或者所含有的基因组相互作用， 通过改变流动相的组成或者pH值而实现分离。 2.1 亲和色谱 2.1.1 肝素亲和层析 在1998年，人们首次发现细胞表面的 硫酸乙酰肝素糖胺多糖（HSGAG）是一种细胞受体，能够与 AAV2病毒载体相结合[14-15] 。基于肝素亲和层析的结构与硫酸 肝素蛋白聚糖相似性，建立了肝素亲和层析分离纯化方法，成 为AAV2最为普遍使用的纯化方法[16-17] 。但是该方法很难用于 以HSGAG受体以外的其他血清型载体。相似的原理，采用黏 蛋白结合色谱分离AAV4和AAV5，见表1。 表1 分离纯化AAV载体的亲和色谱类型和种类 色谱类型 肝素亲和色谱 免疫亲和色谱 生物素亲和色谱 固定化金属镍亲和色谱 黏蛋白亲和色谱 色谱种类 Poros HE、Heparin agarose AVB sepharose HP/A20 Mab coupled to HiTrap-Separose Monomeric avidin agaros Ni-NTA agarose Mucin Sepharose 血清型 AAV2 AAV1、AAV2、AAV8 AAV1 AAV2、AAV8 AAV4、AAV5 参考文献 [18-21] [22-23] [24] [25] [26] 2.1.2 免疫亲和层析 AAV血清型不同，衣壳蛋白组成结构 不同，衣壳表面抗原与固定相抗体相互作用，采用这种免疫亲 和色谱方法分离AAV。例如，对插入生物素受体肽（Biotin ac- 腺相关病毒载体纯化技术的研究进展 曲伟红 1，2＊ （1.华侨大学分子药物研究院，福建 泉州 362021；2.九江学院药学与生命科学学院，江西 九江 332000） 中图分类号 R945 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2015）34-4880-05 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2015.34.41 摘 要 目的：综述腺相关病毒（AAV）载体的分离纯化方法，为AAV的规模化制备提供参考。方法：以“AAV”“Purity”“Chromatography”“腺相关病毒”“纯化”等为关键词，组合检索 2000年1月－2015年 8月在 PubMed、Web of Science、Elsevier、中国知网、 维普等数据库中有关 AAV 分离纯化的文献，选择有代表性的文献进行归纳、总结，分别从AAV纯化的超速离心法、液相色谱法、 化学试剂法和超滤法等4个方面进行综述。结果：共查阅到相关文献260余篇，其中有效文献48篇。液相色谱法纯化AAV表现优 异，亲和色谱、离子交换色谱等色谱技术已经广泛用于AAV1、2、4、5、6、8、9等不同血清型载体的分离纯化，甚至较难分离的AAV 的空壳载体也可以实现分离。但是每种血清型载体的理化性质不尽相同，很难用同一种方法纯化所有载体。结论：液相色谱法 在规模化纯化AAV载体具备良好优势，但是应该根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。 关键词 腺相关病毒；超速离心；液相色谱；纯化工艺 图1 超速离心法分离纯化AAV AAV载体 空AAV颗粒 蛋白类杂质 细胞裂解液 PEG沉淀 第一次纯化 第二次纯化 AAV ·4880·
ceptor peptide,BAP)的AAV1、2、34、5的衣壳,可以采用抗生 表2分离纯化AAV载体的离子色谱类型及种类 物素蛋白(即亲和素)亲和层析进行纯化,获得的AAV的纯色谱类型 色谱种类 血清型 参考献 度大于967%,且转导效率、靶向性与离子交换层析纯化的结阴离子交换色谱 Paras hQ AVAV2、AV4、AAV5、,AV6AV88.y4-刘 果无明显差异。相似的,采用琼脂糖凝胶分离AAV1、AAV2和 AAV8,通过简单纯化就可以得到95%以上纯度的载体四。 AAV、AV2AV 这项技术的优势是适应性好,适用于多种AAV血清型载体,分 离效果良好,一般一步纯化即可得到纯度较高的AAV。不足 DEAE Macroprep 网网网 之处是:①以单克隆抗体为载体,从数百升的细胞裂解液或者 Q-Sepharose AAVI、AV2 培养基中分离AAV,成本较高;②由于抗原抗体结合比较牢 M-QA monolithic dis 固,因此该分离和洗脱条件是比较严格的,甚至要求非常低 Soure 15Q 的pH(如AVB色谱分离AAV1和AAV8所采用的pH为27) 阳离子交换色谱Pam50H5 AAV2、AW9 ,别9 高盐等;③在规模化纯化过程中,在线消毒剂会影响配体的稳 4V2、AV5 定性吗 Fnactogel EMD S03 AA 2.13固定化金属镍亲和层析根据AAV2或者AAV8文库阳离子交换膜 Mustang.S, stang Q A.1AHAA8 选择适宜肽段,在衣壳上插入组氨酸序列(His6),再利用次氨混合色谱 AAV9. AAVI 基三乙酸镍(NNTA)与插入了Hs6标签的AAV2突变型结合子色谱离子交换色谱,能够有效分离空壳病毒,得到的最终 进行固定化金属亲和层析。经此单步柱层析纯化所得AN2、AN产品的蛋白含量低于1%,空壳度实心比率从17:1降至 AAV8突变型的感染性病毒颗粒的产量超过90%,且在体内外02:1(即终产物中的空心病毒颗粒降低了86倍)。该工艺不 研究中表现出与野生型ANV相近的基因转移率及滴度。该法仅适用于血清型AAV2载体,也可用于AAV6载体的纯化。 的优势是选择性广、成本低、条件温和以及色谱结合能力较223混合色谱在AAV9分离纯化时,发现其很难与一些离 高,广泛应用于蛋白质的纯化。不足之处是AN衣壳蛋白需子交换色谱结合,或者即使结合了也很难建立适宜条件进行 要进行突变,形成具有特异金属结合位点門。 洗脱。将陶瓷羟基磷灰石( Ceramic hydroxyapatite chromatog 22离子交换色谱 raphy,CHT)色谱洗脱峰收集液稀释2倍上样至 Poros50HS阳 等电点是一个特殊的pH值,AN的等电点由衣壳表面暴离子交换柱进一步纯化可以得到98%纯度的病毒载体,体内 露的氨基酸侧链,以及包装在载体中的N端或者C端的静电荷 外活性良好。 22.4双离子交换吸收膜双离子交换膜通过暴露在膜表面 221阴离子交换色谱当溶液的pH大于AAV的等电点时,的结合位点能够在最短时间内与AAV结合,缩短作用时间 则可以采用阴离子色谱进行分离,如 Poros HQ、 Poros pl 能够从细胞培养基以及细胞裂解液中捕获AAV载体。相 Source15Q. -Sepharose, HiTrap Q等用于纯化AAV1、24、5、对于柱色谱,吸收膜色谱的体积更小操作比较简便。膜色谱 6、8。为了提高载体纯度需要阴离子交换色谱与阳离子色分离AN载体既可以应用于小规模纯化吗,也可以用于大规 谱、亲和色谱或者超速离心法相互结合叫,见图2。本课题组 模纯 Okada t等"报道,使用双离子吸收膜,可以分离 前期研究比较了几种阴离子交换色谱,发现 HiTrap ANX FF色 AAV1、AAV4、AAV6、AAV8,得到的载体的空壳粒子数少于 谱相比于 HiTrap DEaE F、 HiTrap Q、 HiTrap Q FF色谱,都1%,可以用于体内外研究。 能用于AAV9的分离叫。将含有基因的AAV8载体或者空壳样 离子交换色谱纯化方法的优势:①可以根据实际需要进 品,甚至混合载体与空壳标准样品上样在整体阴离子柱 ( CIM-QA)上,在50~150 mmol/L NaCl梯度洗脱条件下,能得 行调整,能够规模化纯化大体积的细胞裂解液或者AAV粗提 物;②纯化工艺涉及的洗涤、洗脱溶液往往是pH适中的磷酸 到分离度较好的吸收峰,回收率达到9%,根据标准样品以及盐、Tris等缓冲溶液,利于保持病毒载体的生物活性;③所有操 样品的峰面积计算,可以进行AAV8的相对定量珂。分离纯 化AAV载体的离子色谱类型及种类见表2。 作可以在一个封闭的管路内完成,污染较小;④适于AAV1 AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9等多种血清型。不足之 的细胞裂解液 处在于不同血清型的病毒载体理化性质有所差异,因此需要 建立不同血清型载体的纯化方法。 23分子排阻色谱 分子排阻色谱依据病毒载体颗粒大小,将残余的蛋白质 DNA片段等杂质逐步分离。在AAV1分离纯化时, Superdex AAV 200用作溶液更换,以备接下来的离子交换色谱凹。此外,也 图2色谱分离纯化AAV的工艺流程图 可以用于AAV载体进行精制,提高纯度病毒载体門。不过,该 注:正X为离子交换色谱:UC为超速离心法;SEC为分子排阻色谱方法通常很少单独使用需与其他纯化方式相互结合。 222阳离子交换色谱当溶液的pH小于AAV的等电点时,3其他方法 则可以采用阳离子色谱进行分离。在AAV2纯化时,澄清的细3.1化学试剂法 胞裂解液上样于含有100 mmol/L Nacl的20mmoL磷酸盐缓 化学试剂法在病毒载体浓缩沉淀的时候经常使用,是采 冲液(pH7.4)平衡的 Poros5oS柱上,平衡液洗涤,接着用含用硫酸盐、磷酸钙、氯化钙等无机试剂,或者非离子型表面活 有370 mmol/L Nacl的磷酸盐缓冲液洗脱。再经过一次阳离性剂,将AAV沉淀而进行初步分离;也有报道采用化学试 中国药房2015年第26卷第34期 China Pharmacy 2015 Vol 26 No 34. 4881
中国药房 2015年第26卷第34期 China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 34 ceptor peptide ，BAP）的AAV1、2、3、4、5的衣壳，可以采用抗生 物素蛋白（即亲和素）亲和层析进行纯化[27] ，获得的AAV的纯 度大于96.7％，且转导效率、靶向性与离子交换层析纯化的结 果无明显差异。相似的，采用琼脂糖凝胶分离AAV1、AAV2和 AAV8，通过简单纯化就可以得到 95％以上纯度的载体[22-23] 。 这项技术的优势是适应性好，适用于多种AAV血清型载体，分 离效果良好，一般一步纯化即可得到纯度较高的AAV。不足 之处是：①以单克隆抗体为载体，从数百升的细胞裂解液或者 培养基中分离 AAV，成本较高；②由于抗原抗体结合比较牢 固，因此该分离和洗脱条件是比较严格的，甚至要求非常低 的 pH（如 AVB 色谱分离 AAV1 和 AAV8 所采用的 pH 为 2.7）、 高盐等；③在规模化纯化过程中，在线消毒剂会影响配体的稳 定性[11] 。 2.1.3 固定化金属镍亲和层析 根据AAV2 或者AAV8文库 选择适宜肽段，在衣壳上插入组氨酸序列（His6），再利用次氨 基三乙酸镍（Ni-NTA）与插入了His6标签的AAV2突变型结合 进行固定化金属亲和层析。经此单步柱层析纯化所得AAV2、 AAV8突变型的感染性病毒颗粒的产量超过90％，且在体内外 研究中表现出与野生型AAV相近的基因转移率及滴度。该法 的优势是选择性广、成本低、条件温和以及色谱结合能力较 高，广泛应用于蛋白质的纯化。不足之处是AAV衣壳蛋白需 要进行突变，形成具有特异金属结合位点[28] 。 2.2 离子交换色谱 等电点是一个特殊的pH值，AAV的等电点由衣壳表面暴 露的氨基酸侧链，以及包装在载体中的N端或者C端的静电荷 总和决定[29-30] 。 2.2.1 阴离子交换色谱 当溶液的pH大于AAV的等电点时， 则可以采用阴离子色谱进行分离，如 Poros HQ、Poros PI、 Source 15Q、Q-Sepharose、HiTrap Q等用于纯化AAV1、2、4、5、 6 、8。为了提高载体纯度，需要阴离子交换色谱与阳离子色 谱、亲和色谱或者超速离心法相互结合[11] ，见图2。本课题组 前期研究比较了几种阴离子交换色谱，发现HiTrap ANX FF色 谱相比于 HiTrap DEAE FF、HiTrap QXL、HiTrap Q FF 色谱，都 能用于AAV9的分离[31] 。将含有基因的AAV8载体或者空壳样 品，甚至混合载体与空壳标准样品上样在整体阴离子柱 （CIM-QA）上，在50～150 mmol/L NaCl梯度洗脱条件下，能得 到分离度较好的吸收峰，回收率达到99％，根据标准样品以及 样品的峰面积计算，可以进行AAV8的相对定量[32-33] 。分离纯 化AAV载体的离子色谱类型及种类见表2。 2.2.2 阳离子交换色谱 当溶液的pH小于AAV的等电点时， 则可以采用阳离子色谱进行分离。在AAV2纯化时，澄清的细 胞裂解液上样于含有100 mmol/L NaCl 的20 mmol/L磷酸盐缓 冲液（pH 7.4）平衡的Poros 50HS柱上，平衡液洗涤，接着用含 有370 mmol/L NaCl 的磷酸盐缓冲液洗脱。再经过一次阳离 子色谱离子交换色谱，能够有效分离空壳病毒，得到的最终 AAV 产品的蛋白含量低于 1％，空壳/实心比率从 17 ∶ 1 降至 0.2 ∶ 1（即终产物中的空心病毒颗粒降低了86倍）。该工艺不 仅适用于血清型AAV2载体，也可用于AAV6载体的纯化[35] 。 2.2.3 混合色谱 在AAV9分离纯化时，发现其很难与一些离 子交换色谱结合，或者即使结合了也很难建立适宜条件进行 洗脱。将陶瓷羟基磷灰石（Ceramic hydroxyapatite chromatography ，CHT）色谱洗脱峰收集液稀释2倍上样至Poros 50HS阳 离子交换柱进一步纯化，可以得到98％纯度的病毒载体，体内 外活性良好[39] 。 2.2.4 双离子交换吸收膜 双离子交换膜通过暴露在膜表面 的结合位点，能够在最短时间内与AAV结合，缩短作用时间， 能够从细胞培养基以及细胞裂解液中捕获AAV载体[42-43] 。相 对于柱色谱，吸收膜色谱的体积更小，操作比较简便。膜色谱 分离AAV载体既可以应用于小规模纯化[41] ，也可以用于大规 模纯化。Okada T 等[41，43] 报道，使用双离子吸收膜，可以分离 AAV1、AAV4、AAV6、AAV8，得到的载体的空壳粒子数少于 1％，可以用于体内外研究。 离子交换色谱纯化方法的优势：①可以根据实际需要进 行调整，能够规模化纯化大体积的细胞裂解液或者AAV粗提 物；②纯化工艺涉及的洗涤、洗脱溶液往往是pH适中的磷酸 盐、Tris等缓冲溶液，利于保持病毒载体的生物活性；③所有操 作可以在一个封闭的管路内完成，污染较小；④适于 AAV1、 AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9 等多种血清型[44] 。不足之 处在于不同血清型的病毒载体理化性质有所差异，因此需要 建立不同血清型载体的纯化方法。 2.3 分子排阻色谱 分子排阻色谱依据病毒载体颗粒大小，将残余的蛋白质、 DNA 片段等杂质逐步分离。在 AAV1 分离纯化时，Superdex 200用作溶液更换，以备接下来的离子交换色谱[37] 。此外，也 可以用于AAV载体进行精制，提高纯度病毒载体[38] 。不过，该 方法通常很少单独使用，需与其他纯化方式相互结合。 3 其他方法 3.1 化学试剂法 化学试剂法在病毒载体浓缩沉淀的时候经常使用，是采 用硫酸盐、磷酸钙、氯化钙等无机试剂，或者非离子型表面活 性剂，将AAV沉淀而进行初步分离[45-46] ；也有报道采用化学试 图2 色谱分离纯化AAV的工艺流程图 注：IEX为离子交换色谱；UC为超速离心法；SEC为分子排阻色谱 含有AAV的细胞裂解液 IEX IEX IEX IEX UC IEX IEX UC AC IEX IEX SEC AAV 表2 分离纯化AAV载体的离子色谱类型及种类 色谱类型 阴离子交换色谱 阳离子交换色谱 阳/阴离子交换膜 混合色谱 色谱种类 Poros HQ Poros PI HiTrap Q UnoQ Mono Q HR DEAE Macroprep Q-Sepharose CIM-QA monolithic disk Source 15Q Poros 50HS SP Sepharose HP UnoS Fractogel EMD SO3 Mustang-S，ustang-Q CHT 血清型 AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8 AAV2、AAV4、AAV5 AAV1、AAV2、AAV5 AAV1 AAV5 AAV2 AAV1、AAV2 AAV8 AAV2、AAV5、AAV8 AAV2、AAV9 AAV2、AAV5 AAV1 AAV1 AAV1、AAV4、AAV6、AAV8 AAV9、AAV1 参考文献 [8，34-36] [36] [37] [38] [35] [32] [18] [35，39] [40] [37] [37] [41] [37，39] ·4881·
剂结合简单的台式离心机就可以分离AAV,见图3。但是化学[4] Watanabe N, Yano K, Tsuyuki K,eta. Re-examination 试剂法一般不单独使用,常常需要配合超速离心、色谱等方 of regulatory opinions in Europe: possible contribution 联合使用。考虑到离心机需反复使用,该方法不利于AAV的 for the approval of the first gene therapy product Glybera 大规模纯化。 U]. Mol Ther Methods Clin Dev, 2015, doi: 10.1038/ 集解口m□水相出分渔衡 CHCl处理 mtm2014.66. 5]刁勇,王启钊,肖卫东,等重组腺相关病毒载体相关性杂 图3化学试剂法分离AAV 质生物工程学报,2011,27(5):717 [6 Xu ZH. Shi CY, Qian QJ Scalable manufacturing method- 3.2超滤法 ologies for improving adeno-associated virus-based phar 超滤法是AAⅤ浓缩的主要方法,经常用于降低溶液体 maprojects[J). Chin Sci Bull, 2014, 59(16): 1 845 积。通常AAV载体的分子质量超过600kDa,这样的生物大分17] Wang Z, Halbert cl,LeeD,eta. Elimination of con 子很容易被截留而实现浓缩,无机盐、水、小分子蛋白等则可 taminating cap genes in AAv vector virions reduces im- 以通过膜孔。据报道,采用分子截留量为100 kDa mwco的 mune responses and improves transgene expression in a 超滤膜,在10~12psi下,可以将AAV样品溶液浓缩130倍,且 无载体损失。该法的优势是:1)分离过程不发生相变,最大可 canine gene therapy model[J]. Gene Ther, 2014, 21(4) 363 能保持载体活性:2)适用于GMP条件下规模化纯化,在封闭系[8]QuG, Bahr-Davidson. J, Prado J, et al. Separation of ade- no-associated virus type 2 empty particles from genome 与色谱、超速离心法等纯化方法相结合。此外,膜污染也是超 containing vectors by anion-exchange column chromatog- 滤方法不可回避的问题。 raphy [J]. J Virol Methods, 2007, 140(1/2): 183 4结语 [9 Ayuso E, Mingozzi F, Montane J, et al. High AAV vector 在AAV产品中,残余的宿主细胞蛋白、牛血清蛋白、核酸 purity results in serotype and tissue-independent enhance- 酶或者核酸等杂质,不但会影响转染效果,而且会引起免疫反 ment of transduction efficiency]. Gene Therapy, 2010 应。为了得到较高纯度产品,经常需要将超速离心法、液相 17(4):503 色谱法、化学试剂法和超滤法联合应用,如阳离子交换色谱[10 Strobel B, Miller FD, Rist w, et al. Comparative analy Poros hs二次联用纯化AAV2, Poros hs结合阴离子色谱 sis of cesium chloride- and iodixanol-based pur Q- Sepharose色谱纯化AAV6,获得载体纯度大于90%;CHT recombinant adeno-associated viral(AAV )vectors for pre- 色谱联合阴离子色谱纯化AAV1,获得载体纯度大于95% clinical applications]. Hum Gene Ther Methods, 2015 CHT色谱结合 Poros hs纯化AAV9,获得载体纯度与2次超速 26(4):147 离心方法纯化的结果相当;SP阳离子色谱联合阴离子色谱,[ouW, Wang M,WuY,era!. Scalable downstream strate 获得AAV2、AAV8载体纯度大于98%;甚至,采用CsCl或者 gies for purification of recombinant adeno-associated vi- 碘克沙醇超速离心之后,再用双离子吸收膜和CIM色谱进 rus vectors in light of the properties]. Curr Pharm Bio- 一步分离的AAV等载体的纯度均达到99%。这样的高纯 technol,2015,16(8):684 度,能够满足ANV的临床以及临床前研究所需。载体纯度是12] Segura mm. kamen aa, Garnier A. Overview of current 液相色谱纯化工艺设计的一个主要指标。然而,几种纯化方 scalable methods for purification of viral vectors. Meth 法联合使用时使操作步骤增加,在每一个纯化步骤中,回收率 ods in Molecular Biology, 2011, doi: 10.1007/978-1 般在20%~60%,必然会造成载体的损失。目前,上市 61779-09594 销售的 Glybera注射液,位于“天价”药(5.3万欧元/支)之列,其13]唐思,夏素霞,董晓茜,等 LC-MS/MS法测定人血浆中 中一个重要原因,就是如今AAV载体规模化制备成本高、载体 匹伐他汀代谢物匹伐他汀内酯浓度及其药动学研究 纯化的回收率低下。因此,回收率与纯度如何平衡,一直以来 中国药房,2015,26(2):219 是困扰人们的一个主要问题。随着人们对AAV结构和性质了1 Wong FF,HoML, Yamagami M,etal. Effective gene 解的不断深入,液相色谱技术不失为一种有效途径,可稳定地 delivery to valvular interstitial cells using adeno-associat- 生产出安全、有效、廉价的AAV载体药物,更好地满足临床试 ed virus serotypes 2 and 3]. Tissue Eng Part C Methods 验以及市场需求 2015,21(8):808 参考文献 [15 Summerford C. Samulski RJ. Membrane-associated hepa [1 Lisowski L, Tay SS, Alexander IE. Adeno-associated vi ran sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated rus serotypes for gene therapeutics ] Curr Opin Pharma- virus type 2 virions[].J Virol. 1998. 72(2): 1 438 col,2015,17(24):59 [16 Piedra J, Ontiveros M, Miravet S, et al. Development of [2 Gardner MR, Kattenhorn LM, Kondur HR, et al.AAV-ex a rapid, robust, and universal picogreen-based method to pressed eCD4-lg provides durable protection from multi- titer adeno-associated vectors]. Hum Gene Ther Meth- ple SHiv challenges[J]. Nature, 2015, doi: 10.1038/na- ods,2015,26(1):35 [17 Pechan P, Ardinger J, Ketavarapu J, et al. Aurintricar- [3 Scott LJ. Alipogene tiparvovec: a review of its use in adul boxylic acid increases yield of HsV-1 vectors]. Mol ts with familial lipoprotein lipase deficiency). Drugs Ther Methods Clin Dev 2014. doi: 10.1038/mtm2013.6 2015,75(2):175 [18 Brument N, Morenweiser R. Blouin V, et al. A versatile 1882. China Pharmacy 2015 Vol 26 No 34 中国药房2015年第26卷第34期
China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 34 中国药房 2015年第26卷第34期 剂结合简单的台式离心机就可以分离AAV，见图3。但是化学 试剂法一般不单独使用，常常需要配合超速离心、色谱等方法 联合使用。考虑到离心机需反复使用，该方法不利于AAV的 大规模纯化[47] 。 3.2 超滤法 超滤法是 AAV 浓缩的主要方法，经常用于降低溶液体 积。通常AAV载体的分子质量超过 600 kDa，这样的生物大分 子很容易被截留而实现浓缩，无机盐、水、小分子蛋白等则可 以通过膜孔。据报道，采用分子截留量为100 kDa MWCO的 超滤膜，在10～12 psi 下，可以将AAV样品溶液浓缩130倍，且 无载体损失。该法的优势是：1）分离过程不发生相变，最大可 能保持载体活性；2）适用于GMP条件下规模化纯化，在封闭系 统中无菌操作。但是超滤方法一般较少单独使用，通常需要 与色谱、超速离心法等纯化方法相结合。此外，膜污染也是超 滤方法不可回避的问题[11] 。 4 结语 在AAV产品中，残余的宿主细胞蛋白、牛血清蛋白、核酸 酶或者核酸等杂质，不但会影响转染效果，而且会引起免疫反 应[48] 。为了得到较高纯度产品，经常需要将超速离心法、液相 色谱法、化学试剂法和超滤法联合应用，如阳离子交换色谱 Poros HS 二次联用纯化 AAV2，Poros HS 结合阴离子色谱 Q-Sepharose 色谱纯化 AAV6，获得载体纯度大于 90％[8] ；CHT 色谱联合阴离子色谱纯化AAV1，获得载体纯度大于 95％[37] ； CHT色谱结合Poros HS纯化AAV9，获得载体纯度与2次超速 离心方法纯化的结果相当[39] ；SP阳离子色谱联合阴离子色谱， 获得AAV2、AAV8载体纯度大于98％[40] ；甚至，采用CsCl或者 碘克沙醇超速离心之后，再用双离子吸收膜[45] 和CIM色谱进 一步分离的 AAV 等载体的纯度均达到 99％[32] 。这样的高纯 度，能够满足AAV的临床以及临床前研究所需。载体纯度是 液相色谱纯化工艺设计的一个主要指标。然而，几种纯化方 法联合使用时使操作步骤增加，在每一个纯化步骤中，回收率 一般在20％～60％[8，11，37] ，必然会造成载体的损失。目前，上市 销售的Glybera注射液，位于“天价”药（5.3万欧元/支）之列，其 中一个重要原因，就是如今AAV载体规模化制备成本高、载体 纯化的回收率低下。因此，回收率与纯度如何平衡，一直以来 是困扰人们的一个主要问题。随着人们对AAV结构和性质了 解的不断深入，液相色谱技术不失为一种有效途径，可稳定地 生产出安全、有效、廉价的AAV载体药物，更好地满足临床试 验以及市场需求。 参考文献 [ 1 ] Lisowski L，Tay SS，Alexander IE. Adeno-associated virus serotypes for gene therapeutics [J]. Curr Opin Pharmacol，2015，17（24）：59. [ 2 ] Gardner MR，Kattenhorn LM，Kondur HR，et al. AAV-expressed eCD4-Ig provides durable protection from multiple SHIV challenges[J]. Nature，2015，doi：10.1038/nature14264. [ 3 ] Scott LJ. Alipogene tiparvovec：a review of its use in adults with familial lipoprotein lipase deficiency[J]. Drugs， 2015，75（2）：175. [ 4 ] Watanabe N，Yano K，Tsuyuki K，et al. Re-examination of regulatory opinions in Europe：possible contribution for the approval of the first gene therapy product Glybera [J]. Mol Ther Methods Clin Dev，2015，doi：10.1038/ mtm.2014.66. [ 5 ] 刁勇，王启钊，肖卫东，等.重组腺相关病毒载体相关性杂 质[J].生物工程学报，2011，27（5）：717. [ 6 ] Xu ZH，Shi CY，Qian QJ. Scalable manufacturing methodologies for improving adeno-associated virus-based pharmaprojects[J]. Chin Sci Bull，2014，59（16）：1 845. [ 7 ] Wang Z，Halbert CL，Lee D，et al. Elimination of contaminating cap genes in AAV vector virions reduces immune responses and improves transgene expression in a canine gene therapy model[J]. Gene Ther，2014，21（4）： 363. [ 8 ] Qu G，Bahr-Davidson J，Prado J，et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography[J]. J Virol Methods，2007，140（1/2）：183. [ 9 ] Ayuso E，Mingozzi F，Montane J，et al. High AAV vector purity results in serotype and tissue-independent enhancement of transduction efficiency[J]. Gene Therapy，2010， 17（4）：503. [10] Strobel B，Miller FD，Rist W，et al. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral（AAV）vectors for preclinical applications[J]. Hum Gene Ther Methods，2015， 26（4）：147. [11] Qu W，Wang M，Wu Y，et al. Scalable downstream strategies for purification of recombinant adeno-associated virus vectors in light of the properties[J]. Curr Pharm Biotechnol，2015，16（8）：684. [12] Segura MM，Kamen AA，Garnier A. Overview of current scalable methods for purification of viral vectors[J]. Methods in Molecular Biology，2011，doi：10.1007/978-1- 61779-095-9_4. [13] 唐思，夏素霞，董晓茜，等. LC-MS/MS 法测定人血浆中 匹伐他汀代谢物匹伐他汀内酯浓度及其药动学研究[J]. 中国药房，2015，26（2）：219. [14] Wong FF，Ho ML，Yamagami M，et al. Effective gene delivery to valvular interstitial cells using adeno-associated virus serotypes 2 and 3[J]. Tissue Eng Part C Methods， 2015，21（8）：808. [15] Summerford C，Samulski RJ. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions[J]. J Virol，1998，72（2）：1 438. [16] Piedra J，Ontiveros M，Miravet S，et al. Development of a rapid，robust，and universal picogreen-based method to titer adeno-associated vectors[J]. Hum Gene Ther Methods，2015，26（1）：35. [17] Pechan P，Ardinger J，Ketavarapu J，et al. Aurintricarboxylic acid increases yield of HSV-1 vectors[J]. Mol Ther Methods Clin Dev，2014，doi：10.1038/mtm.2013.6. [18] Brument N，Morenweiser R，Blouin V，et al. A versatile PEG/（NH4）2SO4 离心分离 细胞裂解液 PEG沉淀 水相 CHCl3处理 图3 化学试剂法分离AAV ·4882·
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·药师之友 我院1338个药品的储存条件调查及启示△ 白帆’,樊华,田娜,张翠莲“(中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院药剂科,北京100730) 中图分类号R95文献标志码A文章编号1001-0408(2015)34-4884-03 DOl10.6039isn.1001-04082015.34.42 摘要目的:了解我院药品的儲存条件与2013年版《药品经营质量管理规范》GSP)及药品说明书规定的符合程度。方法:参照 2013年版GSP及药品说明书规定,统计我院2013年外购药品中需在阴凉处、冷处、常温及冷冻储存药品所占的比例,回顾性分析 我院药库、药房的储存条件与规定的符合程度。结果:在我院2013年外购的138个药品(国产药品886个,占66.22%;进口或进 口分装药品452个,占33.78%)中,需在冷处和冷冻储存的分别有110个(822%)和3个(0.22%)、阴凉处(包括凉暗处)和常温储 存的分别有271个(2025%)和954个(71.30%)。结论:通过实施持续改进管理,我院可保障药品储存条件符合2013年版GSP及 药品说明书规定。政府相关部门需进一步完善相关法规,提升药品说明书标注储夺条件的可操作性,从而确保药品质量。 关键词药品;储存条件;温度;湿度 Survey and Enlightenment of Storage Condition of 1 338 Kinds of Drugs in Our Hospital BAI Fan, FAN Hua, TIAN Na, ZHANG Cui-lian(Dept of Pharmacy, Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 100730, China) ABSTRACT OBJECTIVE: To investigate the conformance of drug storage condition in our hospital with the criterion of Good Supply Practice of Drug(GSP)or drug instructions. METHODS: The ratio of drugs which should be stored at cold chain or below 20C or room temperature in our hospital in 2013 was analyzed statistically according to drug instruction and GSP(2013 edition) The conformance of storage condition between our hospital and GSP(2013 edition)or drug instructions was analyzed retrospective- ly. RESULTS: Among 1 338 drugs in our hospital in 2013(886 domestic drugs, 66. %: 452 imported or import-packing drugs 33.78%),110 drugs should be refrigerated(8.22%), 3 be frozen (0.22%), 271 be kept below 20 C(20 25 %) and 954 be kept at room temperature(71.30%), respectively. CONCLUSIONS: Through continuous improvement of management, drug storage con- dition could meet the requirements of GSP(2013 edition)and drug instruction. In order to ensure drug quality, the govern should improve related laws and regulations, and promote the operability of storage condition stated in drug instruction. KEYWORDS Drugs: Storage condition; Temperature: Humidity 医院是药品供应链的主要终端环节,药品进入医院后需由原卫生部发布并实施的《药品经营质量管理规范》(GSP) 经药库和药房储存与转运才能用于患者。由于药品成分的特对药品的储存与转运条件作了相应修订,同年10月国家食品 殊性质,有些药品受热、受潮后易引起变性、效价降低或变质;药品监督管理总局(CFDA)还发布了关于冷藏、冷冻药品的储 还有些药品因温度过低,易发生冻结、冻裂、分层或结晶,因此存与运输管理等5个附录,说明养护与转运措施的落实是保 药品的储存条件对保证药品质量至关重要。自2013年6月开始,证患者安全、有效用药的基本要求。为此笔者对我院药库与 lysaccharidosis type lI mice[]. Hum Gene Ther, 2014. [48] Basner-Tschakarjan E, Bijiga E, Martino AT. Pre-clinical 25(3):199 assessment of immune responses to adeno-associated vi- [47] Guo P, El-Gohary Y, Prasadan K, et al. Rapid and simp- rus(AAv)vectors[J]. Front Immuno, 2014. doi: 10.3389/ lified purification of recombinant adeno-associated virus fimmu201400028 [J]. J Virol Methods, 2012, 183(2): 139 (收稿日期:2015-07-07修回日期:2015-09-22) (编辑:余庆华) 本档目协勃 Δ基金项目:国家临床重点专科建设项目 四川博文网络科技有限责任公司 药师。研究方向:医院药学。电话:010-69159215。E- mail: hel. 地址:四川省遂宁市射洪县滨江花园C栋 电话:0825668000邮编:629200 #通信作者:主任药师。研究方向:医院药学、药事管理。电话: 010-69156520.e-mAil:zhangcuilian36a163.com 1884. China Pharmacy 2015 Vol 26 No 34 中国药房2015年第26卷第34期
China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 34 中国药房 2015年第26卷第34期 Δ 基金项目：国家临床重点专科建设项目 ＊药师。研究方向：医院药学。电话：010-69159215。E-mail：hellobaif@163.com # 通信作者：主任药师。研究方向：医院药学、药事管理。电话： 010-69156520。E-mail：zhangcuilian36@163.com 医院是药品供应链的主要终端环节，药品进入医院后需 经药库和药房储存与转运才能用于患者。由于药品成分的特 殊性质，有些药品受热、受潮后易引起变性、效价降低或变质； 还有些药品因温度过低，易发生冻结、冻裂、分层或结晶，因此 药品的储存条件对保证药品质量至关重要。自2013年6月开始， 由原卫生部发布并实施的《药品经营质量管理规范》（GSP）[1] 对药品的储存与转运条件作了相应修订，同年10月国家食品 药品监督管理总局（CFDA）还发布了关于冷藏、冷冻药品的储 存与运输管理等5个附录[2] ，说明养护与转运措施的落实是保 证患者安全、有效用药的基本要求。为此，笔者对我院药库与 ·药师之友· 我院1 338个药品的储存条件调查及启示Δ 白 帆＊，樊 华，田 娜，张翠莲（# 中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院药剂科，北京 100730） 中图分类号 R95 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2015）34-4884-03 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2015.34.42 摘 要 目的：了解我院药品的储存条件与2013年版《药品经营质量管理规范》（GSP）及药品说明书规定的符合程度。方法：参照 2013年版GSP及药品说明书规定，统计我院2013年外购药品中需在阴凉处、冷处、常温及冷冻储存药品所占的比例，回顾性分析 我院药库、药房的储存条件与规定的符合程度。结果：在我院2013年外购的1 338个药品（国产药品886个，占66.22％；进口或进 口分装药品452个，占33.78％）中，需在冷处和冷冻储存的分别有110个（8.22％）和3个（0.22％）、阴凉处（包括凉暗处）和常温储 存的分别有271个（20.25％）和954个（71.30％）。结论：通过实施持续改进管理，我院可保障药品储存条件符合2013年版GSP及 药品说明书规定。政府相关部门需进一步完善相关法规，提升药品说明书标注储存条件的可操作性，从而确保药品质量。 关键词 药品；储存条件；温度；湿度 Survey and Enlightenment of Storage Condition of 1 338 Kinds of Drugs in Our Hospital BAI Fan，FAN Hua，TIAN Na，ZHANG Cui-lian（Dept. of Pharmacy，Peking Union Medical College Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100730，China） ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the conformance of drug storage condition in our hospital with the criterion of Good Supply Practice of Drug（GSP）or drug instructions. METHODS：The ratio of drugs which should be stored at cold chain or below 20 ℃ or room temperature in our hospital in 2013 was analyzed statistically according to drug instruction and GSP（2013 edition）. The conformance of storage condition between our hospital and GSP（2013 edition）or drug instructions was analyzed retrospectively. RESULTS：Among 1 338 drugs in our hospital in 2013（886 domestic drugs，66.22％；452 imported or import-packing drugs， 33.78％），110 drugs should be refrigerated（8.22％），3 be frozen（0.22％），271 be kept below 20 ℃（20.25％）and 954 be kept at room temperature（71.30％），respectively. CONCLUSIONS：Through continuous improvement of management，drug storage condition could meet the requirements of GSP（2013 edition）and drug instruction. In order to ensure drug quality，the government should improve related laws and regulations，and promote the operability of storage condition stated in drug instruction. KEYWORDS Drugs；Storage condition；Temperature；Humidity 本 栏 目 协 办 四川博文网络科技有限责任公司 地址：四川省遂宁市射洪县滨江花园C栋 电话：0825-6698000 邮编：629200 polysaccharidosis typeⅦ mice[J]. Hum Gene Ther，2014， 25（3）：199. [47] Guo P，El-Gohary Y，Prasadan K，et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus [J]. J Virol Methods，2012，183（2）：139. [48] Basner-Tschakarjan E，Bijjiga E，Martino AT. Pre-clinical assessment of immune responses to adeno-associated virus（AAV）vectors[J]. Front Immunol，2014，doi：10.3389/ fimmu.2014.00028. （收稿日期：2015-07-07 修回日期：2015-09-22） （编辑：余庆华） ·4884·