WOvD世华人化杀志 lideng. com/wcjd/ch/index.aspx 世界华人消化杂志2016年7月18日;24(20):3142-314 com/esps/helpdesk. asp ISSN 1009-3079(print) IsSN 2219-2859(online DO:10.1569/wdv24i20.3142 o 2016 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. 肠道菌群的检测方法及研究进展 刘玉婷,郝微微,温红珠,邵兰君 ■背景资料 刘玉婷温红珠,邵兰君,上海中医药大学附属龙华医院消Road,Shanghai200437,China.hao2364ahotmail.com 肠道菌群对人体化科上海市200032 的健康起着保护 Received: 2016-04-25 作用,但是菌群郝微微,上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院消化科 Revised:2016-06-2 在数量、种属、上海市200437 Accepted:2016-06-27 比例等方面失调 Published online: 2016-07-18 与疾病的发生有刘玉婷硕土研究生,主要从事中医约防治青肠疾病的研究 关,随着检测技 术的进展,对肠 道菌群的认识也 床研究基地龙医团队基金资助项目 TD_: Abstract 在不断推进,本 There are a large number of microorganisms 分子生物学技术米作若贡献分布;在文中号元三,理集分中 the human intestine, and they play an 玉婷完成;资料筛选由温红珠与召兰君完成;综述由刘玉婷 important role in digestion and absorption, 检测方法作简要完成 energy metabolism, immune regulation 乍者:郝微微,主任医师,200437,上海市甘河路110号 disease-resistant ability and so on, and are 医药大学附属岳阳中西医结合医院消化科 associated with the development of many diseases. The intestinal flora is of important significance for clinical treatment. This review 修回日期:2016-06 focuses on a variety of molecular biology 接受日期:2016-06-27 technologies for intestinal flora research, such 在线出版日期:2016-07-18 as polymerase chain reaction(PCR), PCR based 16 S rDNA fingerprinting, fluorescence Intestinal flora detection n situ hybridization, gene chip, metagenome methods and research sequencing and so on, as well as the prospects for the research of intestinal flora advances The Author(s) 2016. Published by Baishideng Yu-ling Lu, We-We Hao, Hong-Zhu Wen, Lan-Jun Shao Publishing Group Inc. All rights reserved Wen, Lan-Jun Shao, Department Key Words: Intestinal flora; Detection methods; TCM. Shanghai 200032. China Liu YT, Hao ww, Wen Hz, Shao L Affiliated to Shanghai University of TCM, Detection methods and research Huaren Xiaohua Zazhi 2016; 24 (20) URL http://www.wignet.com/1009-3079/full/v24/ Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationofi20/3142.htmDol:http://dx.doi.org/10.11569/wcjd China. No 62: Nation Clinical Research v.1203142 Base Longyi Team Project, No. LYTD-09, 2012 Shanghai Natural Science Foundation, No. 12ZR1432000 同行评议者 Correspondence to: Wei-Wei Hao, Chief Physician, j54 谭周进,教授,湖 Department of Gastroenterology, Yueyang Hospital 南中医药大学 Affiliated to Shanghai University of TCM, 110 Ganhe人的肠道中栖息着大量微生物,在消化吸 3142 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
WCJD|www.wjgnet.com 3142 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■背景资料 肠道菌群对人体 的健康起着保护 作用, 但是菌群 在数量、种属、 比例等方面失调 与疾病的发生有 关, 随着检测技 术的进展, 对肠 道菌群的认识也 在不断推进, 本 文就几种常用的 分子生物学技术 检测方法作简要 阐述. 刘玉婷, 温红珠, 邵兰君, 上海中医药大学附属龙华医院消 化科 上海市 200032 郝微微, 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院消化科 上海市 200437 刘玉婷, 硕士研究生, 主要从事中医药防治胃肠疾病的研究. 基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 81403362; 国 家中医临床研究基地龙医团队基金资助项目, No. LYTD-09; 2012年度上海市自然基金资助项目, No. 12ZR1432000. 作者贡献分布: 本文由郝微微指导完成; 资料搜集与分析由刘 玉婷完成; 资料筛选由温红珠与邵兰君完成; 综述由刘玉婷 完成. 通讯作者: 郝微微, 主任医师, 200437, 上海市甘河路110号, 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院消化科. hao2364@hotmail.com 收稿日期: 2016-04-25 修回日期: 2016-06-21 接受日期: 2016-06-27 在线出版日期: 2016-07-18 Intestinal flora: Detection methods and research advances Yu-Ting Liu, Wei-Wei Hao, Hong-Zhu Wen, Lan-Jun Shao Yu-Ting Liu, Hong-Zhu Wen, Lan-Jun Shao, Department of Gastroenterology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200032, China Wei-Wei Hao, Department of Gastroenterology, Yueyang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200437, China Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81403362; National TCM Clinical Research Base Longyi Team Project, No. LYTD-09; 2012 Shanghai Natural Science Foundation, No. 12ZR1432000. Correspondence to: Wei-Wei Hao, Chief Physician, Department of Gastroenterology, Yueyang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, 110 Ganhe Road, Shanghai 200437, China. hao2364@hotmail.com Received: 2016-04-25 Revised: 2016-06-21 Accepted: 2016-06-27 Published online: 2016-07-18 Abstract There are a large number of microorganisms in the human intestine, and they play an important role in digestion and absorption, energy metabolism, immune regulation, disease-resistant ability and so on, and are associated with the development of many diseases. The intestinal flora is of important significance for clinical treatment. This review focuses on a variety of molecular biology technologies for intestinal flora research, such as polymerase chain reaction (PCR), PCRbased 16 S rDNA fingerprinting, fluorescence in situ hybridization, gene chip, metagenome sequencing and so on, as well as the prospects for the research of intestinal flora. © The Author(s) 2016. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. Key Words: Intestinal flora; Detection methods; Molecular biology techniques Liu YT, Hao WW, Wen HZ, Shao LJ. Intestinal flora: Detection methods and research advances. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2016; 24(20): 3142-3148 URL: http://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v24/ i20/3142.htm DOI: http://dx.doi.org/10.11569/wcjd. v24.i20.3142 摘要 人的肠道中栖息着大量微生物, 在消化吸 肠道菌群的检测方法及研究进展 刘玉婷, 郝微微, 温红珠, 邵兰君 在线投稿: http://www.baishideng.com/wcjd/ch/index.aspx 帮助平台: http://www.wjgnet.com/esps/helpdesk.aspx DOI: 10.11569/wcjd.v24.i20.3142 世界华人消化杂志 2016年7月18日; 24(20): 3142-3148 ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) © 2016 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. 文献综述 REVIEW ® ■同行评议者 谭周进, 教授, 湖 南中医药大学
刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 收、能量代谢、免疫调节、抗病能力等方很难模拟自然环境的条件,因而无法得到其纯■研发沿 面发挥着重要作用,与很多疾病的发生发展培养物而且细菌培养涉及多种培养基的选择后续研究肠道微 相关.研究肠道菌群对临床治疗具有非常重和对微生物的检测,这在很大程度上取决于技生物与人的肥 要的意义本综述着重论述聚合酶链式反应术人员的经验和技巧η.此外,培养法只能培养的关系提供重要 技术( polymerase chain reaction,PCR)、基于活的细菌,而死的细菌却无法计数因此,培养的理论依据已 有学者提出将宏 光原位杂交、基因芯片、宏基因组测序技法得出菌群失调的理论不够精确而分子生物基安与求进 术等多种分子生物学技术在肠道菌群研究学技术方法的出现则为这些细菌的检测提供检测肠道菌群及 方面的应用,并对未来肠道菌群方面的研究了可能,他具有检测时间短、灵敏度高、结果其代谢产物来评 进行展望,希望为临床研究提供参考. 准确等优势,弥补了传统培养法的诸多不足,对人体的功效 被广泛地应用于肠道微生态生物研究时 The Author(s)2016. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved 2聚合酶链式反应技术 关键词:肠道菌群;检测方法;分子生物学技术聚合酶链式反应技术( polymerase chain reaction PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分 核心提示:分子生物学技术为菌群的研究提供子生物学技术,主要通过变性、退火、延伸三 了一个新视角,然而人类已经不仅仅满足于从个步骤完成参与复制的主要因素有DNA聚合 定性和定量的角度去分析肠道菌群的变化, 序技术使大规模菌群多样性研究成为可能 酶、连接酶、引物、核苷酸原料等 2.1针对16 S TRNA/DNA的PCR16 SIRNA基因 刘玉婷,郝微微,温红珠,邵兰君.肠道菌群的检测方法〗 是编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有 究进展世界华人消化杂志2016,2420:3142-3148URL:细菌的基因组中,具有高度保守性及变异性 http://www.wignet.com1009-3079uM24203142htm根据保守性设计出细菌通用引物,而可变区的 Dol:http:ldx.doi.org/10.11569/wcd.v24.120.3142 差异可以用来区分不同的细菌,一个16 SIrNA 的基因序列就代表着一种原核生物叫. Tiveljung 0引言 等使用16SDNA扩增技术,在克隆恩病患者 人的肠道中寄存着数量巨大、组成复杂的细菌病变肠组织中检测到李斯特菌和大肠埃希菌, 群,也是人体最庞大、最复杂的微生物群落,包从而推测出菌群紊乱与发病有关但是该方法 括大约30属1000多种细菌一般情况下,肠道存在一定的局限性 菌群与人体及外部环境保持着一个平衡状态,2.2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR(real 对人体的健康起着保护作用.然而,一旦菌群在 time quantitative poly merase chain reaction 数量、种属、比例等方面失调,这种平衡被打 qRT-PCR)反应中,引入荧光化学物质,随着 破,就可引起疾病.比如有研究发现溃疡性PCR反应的进行,产物不断累积,荧光信号也 结肠炎患者粪便中双歧杆菌的数量明显减少,不断增强,这时对荧光信号进行检测,通过标 肠球菌增加肝硬化患者肠杆菌科细菌明显增准曲线对未知模板进行分析,从而实现对起始 多,双歧杆菌和乳酸杆菌减少同时,许多疾模板的定量和定性分析.因此,与常规PCR相 病也可以引起菌群的失调,从而加重病情肠道比,实时荧光定量分析具有特异性强、灵敏 细菌的分析是一种非常复杂的工作,随着检测度高、重复性好、自动化程度高的特点,与 技术的进展,对肠道细菌的认识也在不断推进DGGE等传统分子技术相比,该技术可定量到 以下就几种常用的检测方法作简要分析 种的水平,具有其独特的优势叫 国内已有学者建立了较为系统的包括硬 1细菌培养 壁菌门菌等在内的9种肠道菌群及总量的荧光 传统培养法是微生物鉴定的基本方法,但存在定量PCR检测体系,不仅可以检测肠道各菌群 耗时长、培养要求高、影响因素多等问题.更的组成及特征,还可以定量分析,动态监测肠 重要的是,因为有些微生物要求的生长条件苛道菌群的数量变化,相对于之前的检测方法更 刻,有些是绝对的严格厌氧菌,还有些是在自加系统和全面L等采用实时荧光定量 然环境中与其他微生物形成共生关系,实验室PCR研究急性重症胰腺炎大鼠肠道菌群的变 3143 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3143 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■研发前沿 宏基因组测序为 后续研究肠道微 生 物 与 人 的 肥 胖、肠炎等疾病 的关系提供重要 的理论依据. 已 有学者提出将宏 基因组学与代谢 组学结合, 通过 检测肠道菌群及 其代谢产物来评 价药物、食物等 对人体的功效. 收、能量代谢、免疫调节、抗病能力等方 面发挥着重要作用, 与很多疾病的发生发展 相关. 研究肠道菌群对临床治疗具有非常重 要的意义. 本综述着重论述聚合酶链式反应 技术(polymerase chain reaction, PCR)、基于 PCR基础上的16S rDNA指纹图谱技术、荧 光原位杂交、基因芯片、宏基因组测序技 术等多种分子生物学技术在肠道菌群研究 方面的应用, 并对未来肠道菌群方面的研究 进行展望, 希望为临床研究提供参考. © The Author(s) 2016. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. 关键词: 肠道菌群; 检测方法; 分子生物学技术 核心提示: 分子生物学技术为菌群的研究提供 了一个新视角, 然而人类已经不仅仅满足于从 定性和定量的角度去分析肠道菌群的变化, 测 序技术使大规模菌群多样性研究成为可能. 刘玉婷, 郝微微, 温红珠, 邵兰君. 肠道菌群的检测方法及研 究进展. 世界华人消化杂志 2016; 24(20): 3142-3148 URL: http://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v24/i20/3142.htm DOI: http://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v24.i20.3142 0 引言 人的肠道中寄存着数量巨大、组成复杂的细菌 群, 也是人体最庞大、最复杂的微生物群落, 包 括大约30属1000多种细菌[1] . 一般情况下, 肠道 菌群与人体及外部环境保持着一个平衡状态, 对人体的健康起着保护作用. 然而, 一旦菌群在 数量、种属、比例等方面失调, 这种平衡被打 破, 就可引起疾病. 比如, 有研究[2-4] 发现溃疡性 结肠炎患者粪便中双歧杆菌的数量明显减少, 肠球菌增加. 肝硬化患者肠杆菌科细菌明显增 多, 双歧杆菌和乳酸杆菌减少[5,6] . 同时, 许多疾 病也可以引起菌群的失调, 从而加重病情. 肠道 细菌的分析是一种非常复杂的工作, 随着检测 技术的进展, 对肠道细菌的认识也在不断推进. 以下就几种常用的检测方法作简要分析. 1 细菌培养 传统培养法是微生物鉴定的基本方法, 但存在 耗时长、培养要求高、影响因素多等问题. 更 重要的是, 因为有些微生物要求的生长条件苛 刻, 有些是绝对的严格厌氧菌, 还有些是在自 然环境中与其他微生物形成共生关系, 实验室 很难模拟自然环境的条件, 因而无法得到其纯 培养物; 而且细菌培养涉及多种培养基的选择 和对微生物的检测, 这在很大程度上取决于技 术人员的经验和技巧[7] . 此外, 培养法只能培养 活的细菌, 而死的细菌却无法计数, 因此, 培养 法得出菌群失调的理论不够精确. 而分子生物 学技术方法的出现则为这些细菌的检测提供 了可能, 他具有检测时间短、灵敏度高、结果 准确等优势, 弥补了传统培养法的诸多不足, 被广泛地应用于肠道微生态生物研究[8] . 2 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分 子生物学技术, 主要通过变性、退火、延伸三 个步骤完成. 参与复制的主要因素有DNA聚合 酶、连接酶、引物、核苷酸原料等. 2.1 针对16S rRNA/DNA的PCR 16SrRNA基因 是编码rRNA相对应的DNA序列, 存在于所有 细菌的基因组中, 具有高度保守性及变异性. 根据保守性设计出细菌通用引物, 而可变区的 差异可以用来区分不同的细菌, 一个16SrRNA 的基因序列就代表着一种原核生物[9] . Tiveljung 等[10] 使用16SrDNA扩增技术, 在克隆恩病患者 病变肠组织中检测到李斯特菌和大肠埃希菌, 从而推测出菌群紊乱与发病有关. 但是该方法 存在一定的局限性 2.2 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)反应中, 引入荧光化学物质, 随着 PCR反应的进行, 产物不断累积, 荧光信号也 不断增强, 这时对荧光信号进行检测, 通过标 准曲线对未知模板进行分析, 从而实现对起始 模板的定量和定性分析. 因此, 与常规PCR相 比, 实时荧光定量分析具有特异性强、灵敏 度高、重复性好、自动化程度高的特点, 与 DGGE等传统分子技术相比, 该技术可定量到 种的水平, 具有其独特的优势[11] . 国内已有学者建立了较为系统的包括硬 壁菌门菌等在内的9种肠道菌群及总量的荧光 定量PCR检测体系, 不仅可以检测肠道各菌群 的组成及特征, 还可以定量分析, 动态监测肠 道菌群的数量变化, 相对于之前的检测方法更 加系统和全面[12-14] . Li等[15] 采用实时荧光定量 PCR研究急性重症胰腺炎大鼠肠道菌群的变
刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 ■相吴报道 化,发现盲肠部位的大肠杆菌数量增多,而乳不同的DNA片段区分开来DGGE分辨率高,适 采用工RFLP分杆菌和双歧杆菌的数量大大减少.Kim等采用于检测100500bp的片段,不需同位素掺入 析痛性结肠炎用实时荧光定量PCR对30例功能性便秘患者避免了同位素污染由于肠道微生物种类很 UC)小鼠的肠道的研究发现,他们肠道菌群的双歧杆菌和拟杆只有占群落1%以上的种群才能被检测出来P2 菌群的多样性和菌的数量减少,通过益生菌的治疗,肠道菌群DGGE具有技术可靠、可重复、快速和容易操 肠遁菌群发生了可以恢复正常 作的特点,可直接显示微生物群落中优势组成 速“单在U23基于PCR基础上的16SDNA指纹技术 成分,可同时对多个样品进行分析湖 的发病中起了一23.1肠道细菌基因间重复序列-PCR:肠道细 周帅等采用 DGGE-PCR方法研究脓毒 定的作用 菌基因间重复序列( enterobacterial repetitive症大鼠肠道菌群的变化,发现回肠部大肠杆菌 Intergenic consensus,ERIC)是由 Sharple等于增多,乳酸菌和毛螺旋菌科细菌减少,而结肠 1990年在肠道细菌(霍乱弧菌Ⅴ cholerae除外)部大肠杆菌和口腔普雷沃菌增加,乳杆菌减少, 基因组中发现的长约124-127bp的非编码保证明了回肠和结肠的菌群发生显著改变,不同 守重复序列,ERIC-PCR扩增产物的大小为肠段的菌群变化规律也不同 50-3000bp,每种菌株均存在着数目不等的各 梯度凝胶电泳( temperature gradient 自独特的电泳带型,且主带型能够重复稳定出 gel electrophoresis,TGGE技术的基本原理与 现,可用来区别不同种的细菌和同一种细菌DGGE技术相似,凝胶温度梯度呈线性增加,可 中不同菌株. Di Giovanni等于1999年首次以有效分离PCR产物及目的片段TGGE技术 将这种ERIC-PCR技术应用到混合菌群群落与化学变性剂形成梯度的DGGE技术相比,梯 结构的分析研究上,得到能够反映菌群组成差度形成更加便捷,重现性更强wei等采 异的、重复性好而又稳定的指纹图谱.因此,用TGGE-PCR对三只大熊猫的肠道菌群进行 ERIC-PCR的指纹图谱能很好地记录混合菌群研究,认为熊猫的肠道细菌的种类与其他食草 的微生物生态结构信息.在医学研究中,该技动物有很大区别,而肠道菌群的失衡导致竹 术主要用来分析肠道菌群的多样性,通过不同子在肠道中不易被消化国内学者用TGGE技 样品间条带的分布、亮度和数量的变化,推测术分析人肠道中双歧杆菌的组成.之所以采用 出菌群的变化,也可回收DNA主带,进行克隆TGGE技术,是因为其可以显著节约样品DNA 测序,可知样品中的优势菌群,探讨菌群与疾通常用于TGGE分析的DNA仅需十到几十纳 病的关系.鲁海峰曾采用 ERIC-PCR的方法对克,而DGGE一般需180-300ng,对一些肠道内 熊猫肠道微生物结构进行研究,得到大熊猫不双歧杄菌含量较少的个体的样品,选择TGGE 同个体肠道微生物群落结构比较相似且稳定更为灵敏 的结论L等也采用ERIC-PCR技术研究2.33末端限制性片段长度多态性分析:末端限 IBD患者的肠道菌群,证明了健康人比BD患制性片段长度多态性分析( Terminal- restrictio 者的肠道菌群多样性更明显 agent length polymorphism, T-RFLP技术综 2.3.2变性梯度凝胶电泳/TGGE-PCR:变合了PCR技术、DNA限制性酶切技术、毛细 性梯度凝胶电泳( denaturing gradient gel管电泳技术、荧光标记技术和DNA自动测序 electrophoresis, DGGE)技术是由 Fischer于1979仪等技术,通过对特定DNA片段多态性的测定 年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术,来分析比较微生物的群落结构. T-RFLP技术不 起初主要用于医学上, Muyzer等凹在1993年首仅可以进行微生物种类的定性分析,也可以进 次将这项技术应用到微生物群落结构研究方行定量分析.此外,RFLP还显示出各菌株间的 面,发现其在研究微生物种群方面具有很大的DNA差异,故可用作种以下菌株的鉴定.熊婧 优势.他既可以对比分析不同的微生物群落之采用T-RFLP技术分析微生物群落中双歧杆菌 间的差异,也可以研究同一微生物群落的变化的特异性 情况.DGGE的原理是使用具有化学变性剂梯 Hakansson等采用 T-RFLP分析DSS诱导 度的聚丙烯酰胺凝胶,双链DNA片段在聚丙烯的溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群的多样性和 酰胺凝胶电泳时的迁移行为主要取决于其分群落结构,发现肠道菌群的总量及乳杆菌、大 子的大小和带电荷的多少,使同样长度但序列肠杆菌等的数量均发生了改变,从而证明肠 . 5Aishideng 3144 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3144 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■相关报道 国外Håkansson 采用T-RFLP分 析溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC)小鼠的肠道 菌群的多样性和 群落结构, 发现 肠道菌群发生了 改变, 从而证明 肠道菌群在U C 的发病中起了一 定的作用. 化, 发现盲肠部位的大肠杆菌数量增多, 而乳 杆菌和双歧杆菌的数量大大减少. Kim等[16] 采 用实时荧光定量PCR对30例功能性便秘患者 的研究发现, 他们肠道菌群的双歧杆菌和拟杆 菌的数量减少, 通过益生菌的治疗, 肠道菌群 可以恢复正常. 2.3 基于PCR基础上的16S rDNA指纹技术 2.3.1 肠道细菌基因间重复序列-PCR: 肠道细 菌基因间重复序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC)是由Sharple等于 1990年在肠道细菌(霍乱弧菌V cho1erae除外) 基因组中发现的长约124-127 bp的非编码保 守重复序列, ERIC-PCR扩增产物的大小为 50-3000 bp, 每种菌株均存在着数目不等的各 自独特的电泳带型, 且主带型能够重复稳定出 现, 可用来区别不同种的细菌和同一种细菌 中不同菌株[17] . Di Giovanni等[18] 于1999年首次 将这种ERIC-PCR技术应用到混合菌群群落 结构的分析研究上, 得到能够反映菌群组成差 异的、重复性好而又稳定的指纹图谱. 因此, ERIC-PCR的指纹图谱能很好地记录混合菌群 的微生物生态结构信息. 在医学研究中, 该技 术主要用来分析肠道菌群的多样性, 通过不同 样品间条带的分布、亮度和数量的变化, 推测 出菌群的变化, 也可回收DNA主带, 进行克隆 测序, 可知样品中的优势菌群, 探讨菌群与疾 病的关系. 鲁海峰曾采用ERIC-PCR的方法对 熊猫肠道微生物结构进行研究, 得到大熊猫不 同个体肠道微生物群落结构比较相似且稳定 的结论[19] . Li等[20] 也采用ERIC-PCR技术研究 IBD患者的肠道菌群, 证明了健康人比IBD患 者的肠道菌群多样性更明显. 2.3.2 变性梯度凝胶电泳/T G G E-PCR: 变 性梯度凝胶电泳(dena turing gr adi ent ge l electrophoresis, DGGE)技术是由Fischer于1979 年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术, 起初主要用于医学上, Muyzer等[21] 在1993年首 次将这项技术应用到微生物群落结构研究方 面, 发现其在研究微生物种群方面具有很大的 优势. 他既可以对比分析不同的微生物群落之 间的差异, 也可以研究同一微生物群落的变化 情况. DGGE的原理是使用具有化学变性剂梯 度的聚丙烯酰胺凝胶, 双链DNA片段在聚丙烯 酰胺凝胶电泳时的迁移行为主要取决于其分 子的大小和带电荷的多少, 使同样长度但序列 不同的DNA片段区分开来. DGGE分辨率高, 适 用于检测100-500 bp的片段, 不需同位素掺入, 避免了同位素污染. 由于肠道微生物种类很多, 只有占群落1%以上的种群才能被检测出来[21,22] . DGGE具有技术可靠、可重复、快速和容易操 作的特点, 可直接显示微生物群落中优势组成 成分, 可同时对多个样品进行分析[23,24] . 周帅等[25] 采用DGGE-PCR方法研究脓毒 症大鼠肠道菌群的变化, 发现回肠部大肠杆菌 增多, 乳酸菌和毛螺旋菌科细菌减少, 而结肠 部大肠杆菌和口腔普雷沃菌增加, 乳杆菌减少, 证明了回肠和结肠的菌群发生显著改变, 不同 肠段的菌群变化规律也不同. 温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)技术的基本原理与 DGGE技术相似, 凝胶温度梯度呈线性增加, 可 以有效分离PCR产物及目的片段. TGGE技术 与化学变性剂形成梯度的DGGE技术相比, 梯 度形成更加便捷, 重现性更强[26] . Wei等[27] 采 用TGGE-PCR对三只大熊猫的肠道菌群进行 研究, 认为熊猫的肠道细菌的种类与其他食草 动物有很大区别, 而肠道菌群的失衡导致竹 子在肠道中不易被消化. 国内学者用TGGE技 术分析人肠道中双歧杆菌的组成. 之所以采用 TGGE技术, 是因为其可以显著节约样品DNA. 通常用于TGGE分析的DNA仅需十到几十纳 克, 而DGGE一般需180-300 ng, 对一些肠道内 双歧杆菌含量较少的个体的样品, 选择TGGE 更为灵敏[28] . 2.3.3 末端限制性片段长度多态性分析: 末端限 制性片段长度多态性分析(Terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)技术综 合了PCR技术、DNA限制性酶切技术、毛细 管电泳技术、荧光标记技术和DNA自动测序 仪等技术, 通过对特定DNA片段多态性的测定 来分析比较微生物的群落结构. T-RFLP技术不 仅可以进行微生物种类的定性分析, 也可以进 行定量分析. 此外, RFLP还显示出各菌株间的 DNA差异, 故可用作种以下菌株的鉴定. 熊婧 采用T-RFLP技术分析微生物群落中双歧杆菌 的特异性[29] . Håkansson等[30] 采用T-RFLP分析DSS诱导 的溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群的多样性和 群落结构, 发现肠道菌群的总量及乳杆菌、大 肠杆菌等的数量均发生了改变, 从而证明肠
刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 道菌群在溃疡性结肠炎的发病中起了一定的见的感染性细菌. ■应用要点 作用.Wang等采用 T-RFLP技术分析哺乳期陈燕飞运用美国俄克拉荷马大学环境是目前的研究热 前后婴儿肠道菌群的变化,并指出 T-RFLP技基因研究中心研发的第5代功能基因芯片,对点,该综主要介 术在研究粪便微生物群变化方面有很大的优酒精性肝硬化、乙型肝炎肝硬化和正常对照为临床科研工作 势此外,国内也有学者建立了人粪便菌群柔三组研究人群的粪便微生物功能结构进行分提供参考价 嫩梭菌类群特异性的 T-RFLP方法,并认为,虽析,发现肝硬化患者肠道微生物功能基因结构 然 T-RFLP与DGGE灵敏度相同,但TRFP技术与正常对照显著不同、涉及营养物质代谢的 重复性更好,定量更准确,实验流程也比DGGE功能基因显著减少 的操作步骤简单很多,适用于大规模样品的比 临床上,基因芯片技术多用于对致病菌的 对,且不同批次的样品之间误差较小,减少人检测.毛正果等围建立的针对16SRNA序列 为误差,并能最低检测到群落中比例为1%的细基因芯片检测系统,能够成功地鉴定临床常见 菌,具有高重复性、高通量、易于数字化等特的14种肠道致病菌.王军等例也对7种腹泻病 点但是 T-RFLP的成本要比DGGE高 致病菌进行检测,检测阳性符合率为100%,敏 感性高于粪便培养方法 3分子探针技术及基因芯片技术 虽然基因芯片技术已经广泛应用于微生 3.1荧光原位杂交荧光原位杂交( luorescent in物研究领域,但也存在一定的缺陷.基因芯片 situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交的提取纯化过程需要手动操作,不可避免会引 基础上,以荧光标记取代同位素标记而形成的 起人为误差,所以,选择误差较小的提取方法 种杂交方法将带有荧光标记的寡核苷酸探是整个检测的基础而且,由于探针的杂交 针直接与经过处理的细胞杂交,使探针渗透到 有一定的错配率,如何区分由此所造成的假阳 细胞内的核酸,用荧光显微镜即可观察到带有性是临床微生物芯片面临的主要挑战另外 杂交荧光标记探针的细胞,通过计算杂交率来基因芯片的技术成本昂贵、复杂、无法鉴定 定量检测和鉴定细菌他不需要通过纯化或扩亚群以及灵敏度等问题也限制了基因芯片的 增步骤,即可在自然或人工的微生物环境中监 发展 测和鉴定不同的微生物个体,同时对群落组成 进行分析在临床工作中,荧光原位杂交技术4宏基因组 (metagenome测序 一般用于对已知菌群的检测,却不能检测未知宏基因组是指环境中全部微小生物(目前主要 菌群.钟燕等选用5种特异性的16 SIRNA寡包括细菌和真菌)DNA的总和,宏基因组学是 核苷酸探针,应用荧光原位杂交技术分析乳糖由Pace和 handelsman于上世纪90年代提出的 不耐受者双歧杆菌的构成.但是,由于部分微门应用学科,直接提取环境样品中的宏基因组 生物也会发出免疫荧光,所以会产生一定的假进行高通量测序和生物信息学分析,寻找和发 阳性和假阴性,而且,若细菌中RNA含量较低,现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法 则检出率也会下降这些都会造成实验误差. Relman实验室和美国基因组研究所于2005年 32基因芯片技术基因芯片又称为DNA微阵第一次全面开展人类肠道宏基因组学的研究 列,是在分子杂交技术基础上发展起来的一种完善我们对肠道微生物多样性的认识国外 新型分子生物技术.基本原理是将大量探针固 Manichanh等向首次采用宏基因组学方法发现 定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,克隆恩病( Crohn's disease,CD)患者粪便样品 通过荧光扫描及计算机分析样品中的基因序中厚壁菌门的多样性较健康人群明显减少,发 列及表达信息,有高通量、高信息量、快速、现了一种新物种的存在2010年,欧盟资助的 样品用量少、造价低、用途广泛等优点可以“人类肠道元基因组计划( MetahIT)”进行了 同时对上千个基因进行快速分析,因此对像肠迄今最大的肠道细菌基因研究,为后续研 道菌群这样成分复杂的样品,基因芯片展现出道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提 很大的优势极大提高了检测效率3翟俊辉供重要的理论依.国内学者利用宏基因组学 等成功制备了大肠埃希菌、伤寒沙门菌等的方法,对乙型肝炎肝硬化患者肠道微生物群 20多种细菌的基因芯片,成功的检测到临床常落结构及功能代谢进行了全面分析,发现乙型 3145 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3145 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■应用要点 肠道菌群的研究 是目前的研究热 点, 该综述主要介 绍各种检测方法, 为临床科研工作 提供参考价值. 道菌群在溃疡性结肠炎的发病中起了一定的 作用. Wang等[31] 采用T-RFLP技术分析哺乳期 前后婴儿肠道菌群的变化, 并指出T-RFLP技 术在研究粪便微生物群变化方面有很大的优 势. 此外, 国内也有学者建立了人粪便菌群柔 嫩梭菌类群特异性的T-RFLP方法, 并认为, 虽 然T-RFLP与DGGE灵敏度相同, 但T-RFLP技术 重复性更好, 定量更准确, 实验流程也比DGGE 的操作步骤简单很多, 适用于大规模样品的比 对, 且不同批次的样品之间误差较小, 减少人 为误差, 并能最低检测到群落中比例为1%的细 菌, 具有高重复性、高通量、易于数字化等特 点[32] . 但是T-RFLP的成本要比DGGE高. 3 分子探针技术及基因芯片技术 3.1 荧光原位杂交 荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交 基础上, 以荧光标记取代同位素标记而形成的 一种杂交方法. 将带有荧光标记的寡核苷酸探 针直接与经过处理的细胞杂交, 使探针渗透到 细胞内的核酸, 用荧光显微镜即可观察到带有 杂交荧光标记探针的细胞, 通过计算杂交率来 定量检测和鉴定细菌. 他不需要通过纯化或扩 增步骤, 即可在自然或人工的微生物环境中监 测和鉴定不同的微生物个体, 同时对群落组成 进行分析. 在临床工作中, 荧光原位杂交技术 一般用于对已知菌群的检测, 却不能检测未知 菌群. 钟燕等[33] 选用5种特异性的16S rRNA寡 核苷酸探针, 应用荧光原位杂交技术分析乳糖 不耐受者双歧杆菌的构成. 但是, 由于部分微 生物也会发出免疫荧光, 所以会产生一定的假 阳性和假阴性, 而且, 若细菌中rRNA含量较低, 则检出率也会下降, 这些都会造成实验误差. 3.2 基因芯片技术 基因芯片又称为DNA微阵 列, 是在分子杂交技术基础上发展起来的一种 新型分子生物技术. 基本原理是将大量探针固 定于支持物上, 然后与标记的样品进行杂交, 通过荧光扫描及计算机分析样品中的基因序 列及表达信息, 有高通量、高信息量、快速、 样品用量少、造价低、用途广泛等优点. 可以 同时对上千个基因进行快速分析, 因此对像肠 道菌群这样成分复杂的样品, 基因芯片展现出 很大的优势极大提高了检测效率[34,35] . 翟俊辉 等[36] 成功制备了大肠埃希菌、伤寒沙门菌等 20多种细菌的基因芯片, 成功的检测到临床常 见的感染性细菌. 陈燕飞[37] 运用美国俄克拉荷马大学环境 基因研究中心研发的第5代功能基因芯片, 对 酒精性肝硬化、乙型肝炎肝硬化和正常对照 三组研究人群的粪便微生物功能结构进行分 析, 发现肝硬化患者肠道微生物功能基因结构 与正常对照显著不同、涉及营养物质代谢的 功能基因显著减少. 临床上, 基因芯片技术多用于对致病菌的 检测. 毛正果等[38] 建立的针对16SrRNA序列的 基因芯片检测系统, 能够成功地鉴定临床常见 的14种肠道致病菌. 王军等[39] 也对7种腹泻病 致病菌进行检测, 检测阳性符合率为100%, 敏 感性高于粪便培养方法[40,41] . 虽然基因芯片技术已经广泛应用于微生 物研究领域, 但也存在一定的缺陷. 基因芯片 的提取纯化过程需要手动操作, 不可避免会引 起人为误差, 所以, 选择误差较小的提取方法 是整个检测的基础[42] . 而且, 由于探针的杂交 有一定的错配率, 如何区分由此所造成的假阳 性是临床微生物芯片面临的主要挑战. 另外, 基因芯片的技术成本昂贵、复杂、无法鉴定 亚群以及灵敏度等问题也限制了基因芯片的 发展. 4 宏基因组(metagenome)测序 宏基因组是指环境中全部微小生物(目前主要 包括细菌和真菌)DNA的总和, 宏基因组学是 由Pace和andelsman于上世纪90年代提出的一 门应用学科, 直接提取环境样品中的宏基因组 进行高通量测序和生物信息学分析, 寻找和发 现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法. Relman实验室和美国基因组研究所于2005年 第一次全面开展人类肠道宏基因组学的研究, 完善我们对肠道微生物多样性的认识[43] . 国外 Manichanh等[44] 首次采用宏基因组学方法发现 克隆恩病(Crohn's disease, CD)患者粪便样品 中厚壁菌门的多样性较健康人群明显减少, 发 现了一种新物种的存在. 2010年, 欧盟资助的 “人类肠道元基因组计划(MetaHIT)”进行了 迄今最大的肠道细菌基因研究, 为后续研究肠 道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提 供重要的理论依[45] . 国内学者利用宏基因组学 的方法, 对乙型肝炎肝硬化患者肠道微生物群 落结构及功能代谢进行了全面分析, 发现乙型
刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 ■名词斛释 肝炎肝硬化患者肠道菌群结构发生改变,为肝 240-244e1[PMID:20400104DOI:10.1016/ 以环境样品中的硬化患者的微生态治疗提供理论依据.虽然 4 Macfarlane S, Furrie E, Cummings JH, Macfarlane 微生物群体基因宏基因测序使大量的新的微生物种群和新的 GT Chemotaxonomic analysis of bacterial 以功能基因筛选基因得以发现,但无法完成某一菌体的具体数 populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis. Clin Infect Di 和测序分析为研量.还有学者提出宏基因组学与代谢组学的联 2004;38:1690-1699[PMID:15227614DOI 物多样种群合应用可以为疾病发生机制的探讨提供理论5 da l galhenage s, Yu l Kurtovic L riorda 系、功能活性、 依据,也可以通过检测肠道菌群及其代谢产物 SM. Gut flora and bacterial translocation in 相互协作关系及来评价药物、食物等对人体的功效 chronic liver disease. World/ Gastroenterol 2006, 与环境之间的关 121493-1502[PMID1657039DO:10.3748/wg 为研究目的的 v12i10.1493 新的微生物研究5结论 Zhao HY, Wang HJ, Lu Z, Xu SZ. Intestinal 就目前现状看,肠道菌群的检测方法研究已经 microflora in patients with liver cirrhosis. Chin Dig Dis2004;5:6467[PMID:15612659DOl: 发展到相当高的水平,传统细菌培养法已经不 573.200400157x] 能满足人们对菌群的认识.分子生物学技术的 ocale C, Rimoldi SG, Pagani C, Grande R, Edna F, Arghittu M, Lunghi G, Maraschini A, Gismondo 开展,为研究者们提供了一个新的视角.然而 IR, Landini MP, Torresani E, Topin F, Sambri V. 随着科学的发展,人类也逐渐不仅仅满足于从 Comparative evaluation of the new xTAG GPP 定性和定量的角度去分析肠道菌群的变化,而 multiplex assay in the laboratory diagnosis of acute gastroenteritis. Clinical assessment and potential 且分子生物技术过程繁琐复杂,结果相对不 application from a multicentre Italian study. Int 精确,覆盖物种有限的缺点也越来越不能满足 Infect Dis2015;34:3337PMD:25749649DOL 101016/jjid201502011 科学的严谨性.测序技术能直接对PCR扩增的8马素霞,李小丽,郑晓燕PCR法与细菌培养法在急 6SDNA片段进行测序,全面、平行分析多个 性腹泻患者沙门氏菌检测中的应用比较.中国病原 主物学杂志2008:3:735-737 样本中的微生物群落信息,使大规模菌群多样 炀,刘作义分子生物学技术对肠道菌群检测分析 性研究成为可能,为认识肠道菌群打开了一扇 的研究现状中国微生态学杂志200921:285-287 大门.近几年来,国外学者采用测序技术研 Tiveljung A, Soderholm JD, Olaison G, Jonasson J, Monstein H]. Presence of eubacteria in biopsies 究肠道菌群的多样性及与疾病的关系.目前 from Crohns disease inflammatory lesions as 粪便菌群移植( (fecal microbiota transplantation, Microbiol199948:263-268PMD:10334593DOL FMT)在很多消化道疾病的治疗上取得了一定 10.1099/0022615-48-3-263 的进步,已有不少研究者采用分子生物学技术 11赵洁,马晨,席晓敏.实时荧光定量PCR技术在肠道 生物领域中的研究进展.生物技术通报2014;12: 研究FMT后患者粪便菌群的变化.FMT也逐渐 61-66 成为研究的热点,但是对于其具体的作用机制12程悦左浩江度虹瑜肠道常见群光定量CR 尚不清楚,能否通过测序技术明确具体的功能13郭世奎,包维民,龚昆梅 SYBR Green ia时荧光定 菌群,提高移植的安全性,尚有待研究.从发 量PCR法分析结直肠癌患者肠道菌群变化中国普 外基础与临床杂志201017:463-46 展趋势来看,将不同的研究技术相互结合来研 14 Castillo M, Martin-Orue SM, Manzanilla eg, 究肠道菌群,将这有助于我们更进一步了解胃 Badiola I, Martin M, Gasa J. Quantification of 肠道微生态系统,为临床治疗提供新的思路和 total bacteria, enterobacteria and lactobacilli populations in pig digesta by real-time PCR. Vet 方法 Microbiol2006;114:165-170[PMID:16384658DOL 10.1016/ j. vetmic2005.11055 6参考文献 15 LiY, Wu H, Deng Y, Liao R, Xi L Yao P [Changes ey RE, Peterson DA, Gordon JI. Ecole in Rats with Severe Acute Pancreatitis]. Shengwu evolutionary forces shaping microbial diver Yixue Gongchengrue Zazhi 2015; 32: 412-417 [PMID: the human intestine. Cell 2006: 124: 837-848 6211263 16 Kim SE, Choi SC, Park Ks, Park MI, Shin JE, Lee 2 Sha S, Xu B, Wang X, Zhang Y, Wang H, Kong TH, Jung Kw, Koo HS, Myung S]. Change of Zhu H, Wu K The biodiversity and composition Fecal Flora and Effectiveness of the short-term of the dominant fecal microbiota in patients with VSL# 3 Probiotic Treatment in Patients with inflammatory bowel disease. Diagn Microbiol Functional Constipation. Neuroga Infect Dis2013;75:245-251[PMD:23276768DO: 2015:21:111-120[PMD:25537674DO10.5056/ 10.1016/i-diagmicrobio 2012. 11.022 jnm14048 hwiertz A, Jacobi M, Frick JS, Richter M, 17 Lupski jR, Weinstock GM. Short, interspersed Rusch K, Kohler H. Microbiota in pediatric inflammatory bowel disease. I Pediatr 2010: 157 genomes. Bacterio! 1992; 174: 4525-4529 [PMID . 5Aishideng 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3146 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■名词解释 宏基因组: 一种 以环境样品中的 微生物群体基因 组 为 研 究 对 象 , 以功能基因筛选 和测序分析为研 究手段, 以微生 物多样性、种群 结 构 、 进 化 关 系、功能活性、 相互协作关系及 与环境之间的关 系为研究目的的 新的微生物研究 方法. 肝炎肝硬化患者肠道菌群结构发生改变, 为肝 硬化患者的微生态治疗提供理论依据[46] . 虽然 宏基因测序使大量的新的微生物种群和新的 基因得以发现, 但无法完成某一菌体的具体数 量. 还有学者提出宏基因组学与代谢组学的联 合应用可以为疾病发生机制的探讨提供理论 依据, 也可以通过检测肠道菌群及其代谢产物 来评价药物、食物等对人体的功效[47] . 5 结论 就目前现状看, 肠道菌群的检测方法研究已经 发展到相当高的水平, 传统细菌培养法已经不 能满足人们对菌群的认识. 分子生物学技术的 开展, 为研究者们提供了一个新的视角. 然而 随着科学的发展, 人类也逐渐不仅仅满足于从 定性和定量的角度去分析肠道菌群的变化, 而 且分子生物技术过程繁琐复杂, 结果相对不 精确, 覆盖物种有限的缺点也越来越不能满足 科学的严谨性. 测序技术能直接对PCR扩增的 16S rDNA片段进行测序, 全面、平行分析多个 样本中的微生物群落信息, 使大规模菌群多样 性研究成为可能, 为认识肠道菌群打开了一扇 大门[48] . 近几年来, 国外学者采用测序技术研 究肠道菌群的多样性及与疾病的关系[49] . 目前 粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation, FMT)在很多消化道疾病的治疗上取得了一定 的进步, 已有不少研究者采用分子生物学技术 研究FMT后患者粪便菌群的变化. FMT也逐渐 成为研究的热点, 但是对于其具体的作用机制 尚不清楚, 能否通过测序技术明确具体的功能 菌群, 提高移植的安全性, 尚有待研究[50] . 从发 展趋势来看, 将不同的研究技术相互结合来研 究肠道菌群, 将这有助于我们更进一步了解胃 肠道微生态系统, 为临床治疗提供新的思路和 方法. 6 参考文献 1 Ley RE, Peterson DA, Gordon JI. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell 2006; 124: 837-848 [PMID: 16497592] 2 Sha S, Xu B, Wang X, Zhang Y, Wang H, Kong X, Zhu H, Wu K. The biodiversity and composition of the dominant fecal microbiota in patients with inflammatory bowel disease. Diagn Microbiol Infect Dis 2013; 75: 245-251 [PMID: 23276768 DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2012.11.022] 3 Schwiertz A, Jacobi M, Frick JS, Richter M, Rusch K, Köhler H. Microbiota in pediatric inflammatory bowel disease. J Pediatr 2010; 157: 240-244.e1 [PMID: 20400104 DOI: 10.1016/ j.jpeds.2010.02.046] 4 Macfarlane S, Furrie E, Cummings JH, Macfarlane GT. Chemotaxonomic analysis of bacterial populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis. Clin Infect Dis 2004; 38: 1690-1699 [PMID: 15227614 DOI: 10.1086/420823] 5 Almeida J, Galhenage S, Yu J, Kurtovic J, Riordan SM. Gut flora and bacterial translocation in chronic liver disease. World J Gastroenterol 2006; 12: 1493-1502 [PMID: 16570339 DOI: 10.3748/wjg. v12.i10.1493] 6 Zhao HY, Wang HJ, Lu Z, Xu SZ. Intestinal microflora in patients with liver cirrhosis. Chin J Dig Dis 2004; 5: 64-67 [PMID: 15612659 DOI: 10.1111/j.1443-9573.2004.00157.x] 7 Vocale C, Rimoldi SG, Pagani C, Grande R, Pedna F, Arghittu M, Lunghi G, Maraschini A, Gismondo MR, Landini MP, Torresani E, Topin F, Sambri V. Comparative evaluation of the new xTAG GPP multiplex assay in the laboratory diagnosis of acute gastroenteritis. Clinical assessment and potential application from a multicentre Italian study. Int J Infect Dis 2015; 34: 33-37 [PMID: 25749649 DOI: 10.1016/j.ijid.2015.02.011] 8 马素霞, 李小丽, 郑晓燕. PCR法与细菌培养法在急 性腹泻患者沙门氏菌检测中的应用比较. 中国病原 生物学杂志 2008; 3: 735-737 9 廖炀, 刘作义. 分子生物学技术对肠道菌群检测分析 的研究现状. 中国微生态学杂志 2009; 21: 285-287 10 Tiveljung A, Söderholm JD, Olaison G, Jonasson J, Monstein HJ. Presence of eubacteria in biopsies from Crohn's disease inflammatory lesions as determined by 16S rRNA gene-based PCR. J Med Microbiol 1999; 48: 263-268 [PMID: 10334593 DOI: 10.1099/00222615-48-3-263] 11 赵洁, 马晨, 席晓敏. 实时荧光定量PCR技术在肠道 微生物领域中的研究进展. 生物技术通报 2014; 12: 61-66 12 程悦, 左浩江, 廖虹瑜. 肠道常见菌群荧光定量PCR 检测方法的建立. 现代预防医学 2014; 41: 4338-4341 13 郭世奎, 包维民, 龚昆梅. SYBR Green I实时荧光定 量PCR法分析结直肠癌患者肠道菌群变化. 中国普 外基础与临床杂志 2010; 17: 463-46 14 Castillo M, Martín-Orúe SM, Manzanilla EG, Badiola I, Martín M, Gasa J. Quantification of total bacteria, enterobacteria and lactobacilli populations in pig digesta by real-time PCR. Vet Microbiol 2006; 114: 165-170 [PMID: 16384658 DOI: 10.1016/j.vetmic.2005.11.055] 15 Li Y, Wu H, Deng Y, Liao R, Xi L, Yao P. [Changes of Intestinal Mucosal Barrier and Intestinal Flora in Rats with Severe Acute Pancreatitis]. Shengwu Yixue Gongchengxue Zazhi 2015; 32: 412-417 [PMID: 26211263] 16 Kim SE, Choi SC, Park KS, Park MI, Shin JE, Lee TH, Jung KW, Koo HS, Myung SJ. Change of Fecal Flora and Effectiveness of the Short-term VSL#3 Probiotic Treatment in Patients With Functional Constipation. J Neurogastroenterol Motil 2015; 21: 111-120 [PMID: 25537674 DOI: 10.5056/ jnm14048] 17 Lupski JR, Weinstock GM. Short, interspersed repetitive DNA sequences in prokaryotic genomes. J Bacteriol 1992; 174: 4525-4529 [PMID:
刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 162445 钟燕,黄承钰应用荧光原位杂交技术分析乳糖不耐■同行评价 18 Di Giovanni GD, Watrud LS, Seidler R, widmer 受者结肠菌群.营养学报2003;25:415-417 本文综述了肠道 F Fingerprinting of mixed bacterial strain Dobrindt U, Agerer F, Michaelis K, Janka菌群检测方法 and BIOLOG gram-negative(GN) substrate A, Buchrieser c, Samuelson m, Svanborg C,能较全面概括目 communities by enterobacterial repetitive Gottschalk G, Karch h, Hacker. Analysis of前常用的分子生 intergenic consensus sequence-PCR (ERIC-PCR) genome plasticity in pathogenic and commensal物学技术,为选 Curr Microbiol199938:217-223[PMD:10069857 Escherichia coli isolates by use of DNA array 19鲁海峰,魏桂芳,李仲逵.ERIC-PCR分子杂交技术 Bacteriol2003185183180PMD:1261847提供了指导,因 分析大熊猫肠道菌群结构.中国微生物杂志2005; DO:10.1128/JB.1856.1831-1840.2003] 17:81-84 8 J, Puel JL. From cochlear cell death较强的临床意义 Li RM, Han Y, Wang JH, Wang ZH. [An analysis of the DNA fingerprinting of intestinal Rev med clienr20088:1006-1019[PMD:18782053 nflammatory bowel disease]. Zhonghe DO:102174/138955708785740599 Zizhi2007;46:9698[PMD:17445429 36翟俊辉,郭兆彪16rDNA基因芯片检测临床常见 21 Muyzer G DGGE/TGGE a method for 感染性细菌临床检验杂志2002;20:133-136 identifying genes from natural ecosystems.Cm37陈燕飞.肝硬化患者肠道微生态研究:从结构到功 Opin Microbio! 1999; 2: 317-322 [PMID: 10383868 能杭州浙江大学,2013 DO:10.1016/ 38毛正果,郑浩轩,王新颖.基因芯片检测常见肠道 22 Meroth CB, Walter Hertel C, Brandt MJ, 致病菌感染的研究与评价.胃肠病学和肝病学杂志 Hammes WP. Monitoring the bacterial population 08;17: dynamics in sourdough fermentation processes by39王军,逢建涛,刘玉瑜.基囚芯片检测7种常见腹泻 using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. 病致病菌方法研究.中国人兽共患病学报2012;28 pPI Environ Microbiol 2003; 69: 475-482 [PMID: 12514030 DOI: 10.1128/AEM.69.1.475-4822003] 40 Liu Y, Bowen NJ, Matyunina L, McDonald J, 23刘霞.应用 PCR-DGGE和 rep-PCR技术对大鼠及成 Prausnitz MR. Gene transfection enhanced 人肝硬化肝移植后肠道菌群多样性的研究.杭州浙 by ultrasound exposure combined with drug 江大学,2011 treatment guided by gene chip analysis. Int J 24 Dar SA, Kuenen JG, Muyzer G Nested PCR Hyperthermia2012;28:349-361IPMD:22621736 denaturing gradient gel electrophoresis approach to O:103109/026567362012669513 determine the diversity of sulfate-reducing bacteria 41 Osterberg FW, Rizzi G, Donolato M, Bejhed RS elex microbial communities Environ Mezger A, Stromberg M, Nilsson M, Stromme Microbiol2005;71:2325230PMD:15870318 M, Svedlindh P, Hansen M. On-chip detection 帅,王晨阳,范朝刚.变形梯度凝胶电泳研究脓毒 of rolling circle amplified DNA molecules from 症大鼠肠道菌群的变化肠外与肠内营养2014;21: Bacillus globigii spores and Vibrio cholerae 236-240 Small2014;10.2877-2882[PMID:24616417DOL 始6宫曼丽,任南琪邢德峰.DGGE/TGGE技术及其在 1002/smll201303325 微生物分子生态学中的应用微生物学报200444:42 Salonen a, Nikkila j, Jalanka- Tuovinen I 845-848 Immonen O, Rajilic-Stojanovic M, Kekkonen RA, 27 Wei G, Lu H, Zhou Z, Xie H, Wang A, Nelson K, alva A, de Vos WM. Comparative analysis of Zhao L. The microbial community in the feces fecal DNA extraction methods with phylogenetic of the giant panda(Ailuropoda melanoleuca)as microarray: effective recovery of bacterial and determined by PCR-TGGE Profiling and clone archaeal DNA using mechanical cell lysis. J library analysis. Microb Ecol 2007: 54: 194-202 Microbiol Methods 2010; 81: 127-134 [PMID PMD17394039DO110.1007/s00248-007-92252] 0171997DO:10.1016/ g. mimet201002007 28庞小燕,张宝让,魏桂芳.应用TGGE技术分析人肠43 Eckburg PB, Bik em, Bernstein CN, Purdom e 道中双歧杆菌的组成微生物学报2005;:45:738-74 ethlefsen L, Sargent M, Gill SR, Nelson Ke, 29熊婧,张思璐,魏霜.属特异性 T-RFLP技术在双歧 Relman DA. Diversity of the human intestinal 杆菌群落分析中的应用.微生物学通报2014;41 microbial flora. Science 2005: 308: 1635-1638 2538-2546 PMID:15831718DO10.1126/ scIence.1110591] 30 Hakansson A, Tormo-Badia N, Baridi A, Xu J, Manichanh C, Rigottier-Gois L, Bonnaud E, Molin G, Hagslatt ML, Karlsson C, Jeppsson B, Gloux K, Pelletier E, Frangeul L, Nalin R, Jarrin Cilio CM, Ahrne S Immunological alteration and C, Chardon P, Marteau P, Roca J, Dore J Reduced changes of gut microbiota after dextran sulfate diversity of faecal microbiota in Crohns disease dium(DsS) revealed by a metagenomic approach. Gut 2006 led2015;15:107-120[PMID:2441342DoI: 55:205-211[PMID:16188921DOI:10.1136/ 10.1007/s10238-013-02705 gut2005.0738171 31 Wang M, Ahrne S, Antonsson M, Molin G. 45 Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf Ks, T-RFLP combined with principal component Manichanh C, Nielsen T, Pons N, Levene F, analysis and 16s rrNa gene sequencing Yamada T, Mende Dr, Li J, Xu J, LiS, Li D, Cao J, an effective strategy for comparison of fecal Wang B, Liang H, Zheng H, Xie Y, Tap ), Lepage microbiota in infants of different ages. J Microbiol P, Bertalan M, Batto JM, Hansen T, Le Paslier D, Methods2004;5953-69[PMID:15325753DOI: Linneberg A, Nielsen HB, Pelletier E, Renault P, Sicheritz-Ponten T, Turner K, Zhu H, Yu C, Li s, 32柳欣源,申剑,王婷婷.T-RFLP技术在人肠道柔嫩 Jian M, Zhou Y, Li Y, Zhang X, Lis, Qin N, Yang H, 梭菌类群的组成分析中的应用.中国微生态学杂志 Wang J, Brunak S, Dore J, Guarner F, Kristianse 200921:696700 K, Pedersen O, Parkhill J, Weissenbach J, Bork +5Aishideng 3147 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3147 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■同行评价 本文综述了肠道 菌 群 检 测 方 法 , 能较全面概括目 前常用的分子生 物学技术, 为选 择何种检测方法 提供了指导, 因 此, 本综述具有 较强的临床意义. 1624445] 18 Di Giovanni GD, Watrud LS, Seidler RJ, Widmer F. Fingerprinting of mixed bacterial strains and BIOLOG gram-negative (GN) substrate communities by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR (ERIC-PCR). Curr Microbiol 1999; 38: 217-223 [PMID: 10069857] 19 鲁海峰, 魏桂芳, 李仲逵. ERIC-PCR分子杂交技术 分析大熊猫肠道菌群结构.中国微生物杂志 2005; 17: 81-84 20 Li RM, Han Y, Wang JH, Wang ZH. [An analysis of the DNA fingerprinting of intestinal flora in inflammatory bowel disease]. Zhonghua Neike Zazhi 2007; 46: 96-98 [PMID: 17445429] 21 M u y z e r G . D G G E / T G G E a m e t h o d f o r identifying genes from natural ecosystems. Curr Opin Microbiol 1999; 2: 317-322 [PMID: 10383868 DOI: 10.1016/S1369-5274(99)80055-1] 22 Meroth CB, Walter J, Hertel C, Brandt MJ, Hammes WP. Monitoring the bacterial population dynamics in sourdough fermentation processes by using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 475-482 [PMID: 12514030 DOI: 10.1128/AEM.69.1.475-482.2003] 23 刘霞. 应用PCR-DGGE和rep-PCR技术对大鼠及成 人肝硬化肝移植后肠道菌群多样性的研究. 杭州: 浙 江大学, 2011 24 Dar SA, Kuenen JG, Muyzer G. Nested PCRdenaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex microbial communities. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 2325-2330 [PMID: 15870318] 25 周帅, 王晨阳, 范朝刚. 变形梯度凝胶电泳研究脓毒 症大鼠肠道菌群的变化.肠外与肠内营养 2014; 21: 236-240 26 宫曼丽, 任南琪, 邢德峰. DGGE/TGGE技术及其在 微生物分子生态学中的应用. 微生物学报 2004; 44: 845-848 27 Wei G, Lu H, Zhou Z, Xie H, Wang A, Nelson K, Zhao L. The microbial community in the feces of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca) as determined by PCR-TGGE profiling and clone library analysis. Microb Ecol 2007; 54: 194-202 [PMID: 17394039 DOI: 10.1007/s00248-007-9225-2] 28 庞小燕, 张宝让, 魏桂芳. 应用TGGE技术分析人肠 道中双歧杆菌的组成. 微生物学报 2005; 45: 738-743 29 熊婧, 张思璐, 魏霜. 属特异性T-RFLP 技术在双歧 杆菌群落分析中的应用. 微生物学通报 2014; 41: 2538-2546 30 Håkansson Å, Tormo-Badia N, Baridi A, Xu J, Molin G, Hagslätt ML, Karlsson C, Jeppsson B, Cilio CM, Ahrné S. Immunological alteration and changes of gut microbiota after dextran sulfate sodium (DSS) administration in mice. Clin Exp Med 2015; 15: 107-120 [PMID: 24414342 DOI: 10.1007/s10238-013-0270-5] 31 Wang M, Ahrné S, Antonsson M, Molin G. T-RFLP combined with principal component analysis and 16S rRNA gene sequencing: an effective strategy for comparison of fecal microbiota in infants of different ages. J Microbiol Methods 2004; 59: 53-69 [PMID: 15325753 DOI: 10.1016/j.mimet.2004.06.002] 32 柳欣源, 申剑, 王婷婷. T-RFLP技术在人肠道柔嫩 梭菌类群的组成分析中的应用. 中国微生态学杂志 2009; 21: 696-700 33 钟燕, 黄承钰. 应用荧光原位杂交技术分析乳糖不耐 受者结肠菌群. 营养学报 2003; 25: 415-417 34 Dobrindt U, Agerer F, Michaelis K, Janka A, Buchrieser C, Samuelson M, Svanborg C, Gottschalk G, Karch H, Hacker J. Analysis of genome plasticity in pathogenic and commensal Escherichia coli isolates by use of DNA arrays. J Bacteriol 2003; 185: 1831-1840 [PMID: 12618447 DOI: 10.1128/JB.185.6.1831-1840.2003] 35 Wang J, Puel JL. From cochlear cell death pathways to new pharmacological therapies. Mini Rev Med Chem 2008; 8: 1006-1019 [PMID: 18782053 DOI: 10.2174/138955708785740599] 36 翟俊辉, 郭兆彪. 16SrDNA基因芯片检测临床常见 感染性细菌. 临床检验杂志 2002; 20: 133-136 37 陈燕飞. 肝硬化患者肠道微生态研究: 从结构到功 能. 杭州: 浙江大学, 2013 38 毛正果, 郑浩轩, 王新颖. 基因芯片检测常见肠道 致病菌感染的研究与评价. 胃肠病学和肝病学杂志 2008; 17: 809-812 39 王军, 逢建涛, 刘玉瑜. 基囚芯片检测7种常见腹泻 病致病菌方法研究. 中国人兽共患病学报 2012; 28: 938-941 40 Liu Y, Bowen NJ, Matyunina L, McDonald J, Prausnitz MR. Gene transfection enhanced by ultrasound exposure combined with drug treatment guided by gene chip analysis. Int J Hyperthermia 2012; 28: 349-361 [PMID: 22621736 DOI: 10.3109/02656736.2012.669513] 41 Østerberg FW, Rizzi G, Donolato M, Bejhed RS, Mezger A, Strömberg M, Nilsson M, Strømme M, Svedlindh P, Hansen MF. On-chip detection of rolling circle amplified DNA molecules from Bacillus globigii spores and Vibrio cholerae. Small 2014; 10: 2877-2882 [PMID: 24616417 DOI: 10.1002/smll.201303325] 42 Salonen A, Nikkilä J, Jalanka-Tuovinen J, Immonen O, Rajilić-Stojanović M, Kekkonen RA, Palva A, de Vos WM. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. J Microbiol Methods 2010; 81: 127-134 [PMID: 20171997 DOI: 10.1016/j.mimet.2010.02.007] 43 Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, Gill SR, Nelson KE, Relman DA. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005; 308: 1635-1638 [PMID: 15831718 DOI: 10.1126/science.1110591] 44 Manichanh C, Rigottier-Gois L, Bonnaud E, Gloux K, Pelletier E, Frangeul L, Nalin R, Jarrin C, Chardon P, Marteau P, Roca J, Dore J. Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. Gut 2006; 55: 205-211 [PMID: 16188921 DOI: 10.1136/ gut.2005.073817] 45 Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, Nielsen T, Pons N, Levenez F, Yamada T, Mende DR, Li J, Xu J, Li S, Li D, Cao J, Wang B, Liang H, Zheng H, Xie Y, Tap J, Lepage P, Bertalan M, Batto JM, Hansen T, Le Paslier D, Linneberg A, Nielsen HB, Pelletier E, Renault P, Sicheritz-Ponten T, Turner K, Zhu H, Yu C, Li S, Jian M, Zhou Y, Li Y, Zhang X, Li S, Qin N, Yang H, Wang J, Brunak S, Doré J, Guarner F, Kristiansen K, Pedersen O, Parkhill J, Weissenbach J, Bork
刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 P, Ehrlich SD, Wang J. A human gut microbial 的进展微生物学通报201441:1195-1202 gene catalogue established by metagenomic 49 Kaakoush NO, Day AS, Huinao KD, Leach ST, sequencing. Nature 2010; 464: 59-65 [PMID: Lemberg DA, Dowd SE, Mitchell HM. Microbial 20203603DOL:10.1038/ naturel882l 46魏晓.乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研 disease. J Clin Microbiol 2012: 50: 3258-3266 [PMID 究北京:中国人民解放军军事医学科学院,2012 22837318DOl:10.1128/JCM01396-1 47 Tuohy KM, Gougoulias C, Shen Q, Walton G, 50 Grehan MJ, Borody T], Leis SM, Campbell J, Fava F, Ramnani P. Studying the human gut Mitchell H, Wettstein A. Durable alteration of microbiota in the trans-omics era.focus or the colonic microbiota by the administration Curr pla of donor fecal flora. Clin Gastroenterol 2010; Des200915:1415-1427[PMD:19442166 44:551-561[PMID:20716985DoI:10.1097/ 48黄卫强,张和平分子生物学技术在肠道菌群研究中 MCG. Ob013e318le5d06b 编辑:于明茜电编:闫晋利 IssN 1009-3079(print) ISsN 2219-2859(online) DOI: 10.11569 O 2016 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved 消息 《世界华人消化杂志》栏目设置 本刊讯本刊栏目设置包括述评,基础研究,临床研究,焦点论坛,文献综述,研究快报,临床经验,病例报告, 会议纪要.文稿应具科学性、先进性、可读性及实用性,重点突出,文字简练,数据可靠,写作规范,表达 确 . 5Aishideng 3148 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I
刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3148 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| P, Ehrlich SD, Wang J. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 2010; 464: 59-65 [PMID: 20203603 DOI: 10.1038/nature08821] 46 魏晓. 乙肝肝硬化患者肠道微生物宏基因组学的研 究. 北京: 中国人民解放军军事医学科学院, 2012 47 Tuohy KM, Gougoulias C, Shen Q, Walton G, Fava F, Ramnani P. Studying the human gut microbiota in the trans-omics era--focus on metagenomics and metabonomics. Curr Pharm Des 2009; 15: 1415-1427 [PMID: 19442166] 48 黄卫强, 张和平. 分子生物学技术在肠道菌群研究中 的进展. 微生物学通报 2014; 41: 1195-1202 49 Kaakoush NO, Day AS, Huinao KD, Leach ST, Lemberg DA, Dowd SE, Mitchell HM. Microbial dysbiosis in pediatric patients with Crohn's disease. J Clin Microbiol 2012; 50: 3258-3266 [PMID: 22837318 DOI: 10.1128/JCM.01396-12] 50 Grehan MJ, Borody TJ, Leis SM, Campbell J, Mitchell H, Wettstein A. Durable alteration of the colonic microbiota by the administration of donor fecal flora. J Clin Gastroenterol 2010; 44: 551-561 [PMID: 20716985 DOI: 10.1097/ MCG.0b013e3181e5d06b] 编辑:于明茜 电编:闫晋利 ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online) DOI: 10.11569 © 2016 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. • 消息 • 《世界华人消化杂志》栏目设置 本刊讯 本刊栏目设置包括述评, 基础研究, 临床研究, 焦点论坛, 文献综述, 研究快报, 临床经验, 病例报告, 会议纪要. 文稿应具科学性、先进性、可读性及实用性, 重点突出, 文字简练, 数据可靠, 写作规范, 表达 准确
g aishideng Published by baishideng Publishing Group Inc 8226 Regency Drive, Pleasanton CA 94588 USA Fax:+1-925-223-8242 Telephone:+1-925-223-8243 E-mail: bpgoffice a http://www.wjgnet.com 口密 上 ISsN1009-3079 20 9771009307056 @2016 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved
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