中华危重病急救医学2016年8月第28卷第8期 Chin crit care med, August2016.Vdl28,No8 综述 细胞共培养方法的研究进展 秦燕勤陈玉龙李建生 450046河南郑州,河南中医学院老年医学研究所(秦燕勤、李建生),分子生物学实验中心 (陈玉龙) 通讯作者:陈玉龙, Email:cyl7262l@163com DOl:10.3760/ cma.Issn.2095-4352.2016.08.022 【摘要】细胞培养技术是目前体外实验中最常用的方法。单层细胞培养因不能完全模拟多细胞相互作用 的体内环境、细胞趋向单一化,而无法探讨多细胞间的相互关系,已不能满足研究者的需求。因此,为了满足科 研需要,细胞共培养技术应运而生,其方法也在实践中不断改进:从直接接触到间接接触,从二维到三维,细胞 共培养模型更接近人体内环境,更有利于研究细胞与细胞之间的相互作用。目前,共培养技术已经被很多学者 用于体外生理及病理模型、组织工程、细胞分化研究,为药物研发(包括中药研发)药物分析以及药物作用机 制及部位等研究热点。对有关细胞共培养方法的研究进行综述,总结各种方法的优点和不足,以促进细胞培养 方法的不断改进,从而建立更加接近人体的多种细胞共培养体系,甚至模拟人体内循环的体外模型。 【关键词】细胞共培养;直接接触共培养;间接接触共培养;三维共培养体系 基金项目:国家自然科学基金(81130062) Research progress of cell co-culture method Qin Yangin, Chen Yulong, Li Jiansheng Institute for Geriatrics, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan, China(Qin yQ. Li JS); Experimental Center of Molecular Biology, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan, China( Chen YL) Corresponding author: Chen Yulong, Email: cyt72621@16 (Abstract) Cell culture technology is the most ly used method in the in vitro experiments at presen However, monolayer cell culture technology has been unable to meet the demand of the researchers. This is because that monolayer cell culture cannot mimic the cellular environment in which multiple cells interact with each other in the body. We cannot discuss the relationship of many cells, because we do not know the relationship between cells through a single kind of cell. So cell co-culture medicine arises at the historic moment for the demand. With the development of research method in recent years, cell co-culture method also has been improved in practice: from direct contact co-cultures to indirect contact co-cultures. from two-dimensional co-cultures to three-dimensional co-cultures. Cell co-culture method is closer to the human body. It is also more advantageous to study the interaction among cells. Nowadays, there are more researchers tend to select this method to study the physiological and model tissue engineering. and cell differentiation research. At the same time, it has hecome the focus of drug research and development, drug analysis, mechanism of drug action, and drug targets. This article will re the studies of cell co-culture method. sum advantages of various methods, so as to promote improvement of cell culture methods, to build cells co-culture close to human body, and build the in vitro model that simulate internal circulation of human body further [Key words] Cell co-culture; Direct contact co-culture; Indirect contact co-culture: Three-dimensional co-culture system Fund program: National Natural Science Foundation of China(81 130062) 细胞培养的历史应追溯到19世纪80年代,德国学者人体内环境存在差距;而细胞共培养技术能弥补单层细胞 Wilhelm roux从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养;培养的缺陷,有利于构建更接近人体状态的体外生理或病理 Earle和 Dulbecco于1943年创建了单层细胞培养。细胞培模型。 养技术于20世纪30年代传入我国,最早开展在植物胚芽的 细胞共培养又称为复合培养或混合培养,是指将2种或 培养上,因其具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用2种以上细胞放在同一培养系统中培养。与单层细胞培养 的优点,被广泛应用于生物学及组织学的各个领域口2]。然技术相比,细胞共培养技术可以很大程度地模拟体内环境 而,单层细胞培养虽然易于操作、培养条件便于调控,但与以便更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互
中华危重病急救医学 2016 年 8 月第 28 卷第 8 期 Chin Crit Care Med，August 2016，Vol.28，No.8 · 765 · ·综述· 细胞共培养方法的研究进展 秦燕勤 陈玉龙 李建生 450046 河南郑州，河南中医学院老年医学研究所（秦燕勤、李建生），分子生物学实验中心 （陈玉龙） 通讯作者：陈玉龙，Email：cyl72621@163.com DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2016.08.022 【摘要】 细胞培养技术是目前体外实验中最常用的方法。单层细胞培养因不能完全模拟多细胞相互作用 的体内环境、细胞趋向单一化，而无法探讨多细胞间的相互关系，已不能满足研究者的需求。因此，为了满足科 研需要，细胞共培养技术应运而生，其方法也在实践中不断改进：从直接接触到间接接触，从二维到三维，细胞 共培养模型更接近人体内环境，更有利于研究细胞与细胞之间的相互作用。目前，共培养技术已经被很多学者 用于体外生理及病理模型、组织工程、细胞分化研究，为药物研发（包括中药研发）、药物分析以及药物作用机 制及部位等研究热点。对有关细胞共培养方法的研究进行综述，总结各种方法的优点和不足，以促进细胞培养 方法的不断改进，从而建立更加接近人体的多种细胞共培养体系，甚至模拟人体内循环的体外模型。 【关键词】 细胞共培养； 直接接触共培养； 间接接触共培养； 三维共培养体系 基金项目：国家自然科学基金（81130062） Research progress of cell co-culture method Qin Yanqin, Chen Yulong, Li Jiansheng Institute for Geriatrics, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan, China (Qin YQ, Li JS); Experimental Center of Molecular Biology, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan, China (Chen YL) Corresponding author: Chen Yulong, Email: cyl72621@163.com 【Abstract】 Cell culture technology is the most commonly used method in the in vitro experiments at present. However, monolayer cell culture technology has been unable to meet the demand of the researchers. This is because that monolayer cell culture cannot mimic the cellular environment in which multiple cells interact with each other in the body. We cannot discuss the relationship of many cells, because we do not know the relationship between cells through a single kind of cell. So cell co-culture medicine arises at the historic moment for the demand. With the development of research method in recent years, cell co-culture method also has been improved in practice: from direct contact co-cultures to indirect contact co-cultures, from two-dimensional co-cultures to three-dimensional co-cultures. Cell co-culture method is closer to the human body. It is also more advantageous to study the interaction among cells. Nowadays, there are more researchers tend to select this method to study the physiological and pathological in vitro model, tissue engineering, and cell differentiation research. At the same time, it has become the focus of drug research and development, drug analysis, mechanism of drug action, and drug targets. This article will review the studies of cell co-culture method, summarize advantages and disadvantages of various methods, so as to promote improvement of cell culture methods, to build cells co-culture system that more close to human body, and build the in vitro model that simulate internal circulation of human body further. 【Key words】 Cell co-culture; Direct contact co-culture; Indirect contact co-culture; Three-dimensional co-culture system Fund program: National Natural Science Foundation of China (81130062) 细胞培养的历史应追溯到 19 世纪 80 年代，德国学者 Wilhelm Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养； Earle 和 Dulbecco 于 1943 年创建了单层细胞培养。细胞培 养技术于 20 世纪 30 年代传入我国，最早开展在植物胚芽的 培养上［1］，因其具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用 的优点，被广泛应用于生物学及组织学的各个领域［2］。然 而，单层细胞培养虽然易于操作、培养条件便于调控，但与 人体内环境存在差距；而细胞共培养技术能弥补单层细胞 培养的缺陷，有利于构建更接近人体状态的体外生理或病理 模型。 细胞共培养又称为复合培养或混合培养，是指将 2 种或 2 种以上细胞放在同一培养系统中培养。与单层细胞培养 技术相比，细胞共培养技术可以很大程度地模拟体内环境， 以便更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互
766· 中华危重病急救医学2016年8月第28卷第8期 Chin crit care med, August2016,Vol.28,Na.8 作用,通过检测不同细胞因子之间的关系,探讨药物的作用间的过渡。宋旆文等利用这种方法观察 BMSCS条件培 机制和可能的作用靶点。细胞共培养技术一直倍受关注,主养基对神经干细胞(NSCs)分化的影响,在彻底避免了2种 要用于研究诱导干细胞分化[、提高代谢物产量5、提高细胞接触产生作用的情况下,观察到NSCs的贴壁分化,肯 细胞生存能力、维持细胞功能和活性、体外组织的构建定了 BMSCS条件培养基对NSCs贴壁分化的积极作用,而 等。目前,细胞共培养方法主要包括直接接触共培养、间不依赖于 BMSCs本身,为BMCs条件培养基与NSCs共同 接接触共培养和三维细胞共培养,3种方法的选择主要根据移植提供了依据。周凌等以鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM) 共培养细胞的正常形态、研究者的目的以及研究能否方便、作为血管生成体内模型,观察到与单层细胞培养相比,人食 顺利进行而决定 管癌细胞株Eca-9706细胞条件培养基可显著增加人脐静脉 1直接接触共培养法 内皮细胞的增殖、迁移以及小管形成。 直接接触共培养是指把2种或2种以上细胞放在同一2.2“爬片式”共培养法:“爬片式”共培养法是将细胞先 培养体系中,使之直接接触。这种方法适用于体内邻近的组接种在处理后的玻片上,待细胞贴璧后,以一定比例放入另 织细胞,主要因为这些细胞在体内可通过通讯连接、封闭连 细胞的培养皿中与其共培养。有研究者用该方法将接 接和锚定连接等方式传递所产生的细胞因子,而直接接触式「种了骨髓单核细胞的玻片或骨片置入提前24h接种了成骨 培养可保留这些连接信息,使培养的细胞更接近体内自然状细胞的培养皿中进行共培养,结果显示,成骨细胞对破骨细 态;该方法还适用于2种生长状态相同的细胞,例如2种胞的调控作用显著,诱导的破骨细胞具有噬骨能力,成功建 贴壁细胞或2种悬浮细胞。这种方法的优点是操作方便 立了共培养模型,用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控 对培养皿或培养瓶的要求较低,一般常用的细胞支持物即作用研究{ 可。该方法主要用于研究细胞间相互作用以及诱导细胞分∠23嵌人式细胞共培养法(Tmw小室):嵌入式共培养 化。刘尧将人骨髓间充质干细胞( hBMSCs)与人软骨细法又称“筏式”培养法或 Transwell共培养体系,是指将带有 胞(hACs)从人体分离培养后接种于丝素蛋白支架上进行聚碳酯(PC)、聚酯(PET)或胶原包被的聚四氟乙烯(PTFE) 直接共培养,通过苏木素-伊红(HE)染色技术、Ⅱ型胶原膜的 Transwell小室放在相应的培养板上建立的共培养体系 染色技术观察细胞形态,并与在同样支持物下用诱导剂培养 Transwell小室底部的膜将上下层细胞分开,膜的直径小于 的 hBMSCs,以及单纯hACs进行比较,发现 hBMSCs与hACs3.0m,一般为04m,细胞不能自由通过此膜,但细胞因子 直接接触共培养有利于软骨细胞外基质的产生。Wamk0可以自由通过两者可通过此膜进行信息交流。嵌入式细胞 等发现,在与自身骨髓间充质干细胞( BMSCs)的相互接共培养法是目前应用最多的方法。这种间接共培养法可用 触共培养中,人髓核细胞生物学活性明显提高。还有研究表于各种生长状态的细胞,其优点是便于分离2种细胞,可更 明,将内皮细胞和神经干细胞直接接触共培养后,在血管内 C 好地观察其各自的细胞状态变化,以探讨一种细胞对另一种 皮生长因子的作用下,内皮细胞可以促进神经干细胞增殖,细胞的作用。Ca等20采用 Transwell小室共培养处理过的 并有向神经细胞分化的趋势2 内皮细胞和上皮细胞,探讨了多壁碳纳米管棕榈酸在心血管 临床细胞移植治疗也可以被看作是外源细胞和自身细疾病中的作用。张明{通过分离、培养人纤维环(AF)细胞 胞的直接接触共培养,其中间充质干细胞因易获得、易培与 BMSCs,分别吸取第3代AF细胞和 BMSCS,按1:1比例 养、较稳定,具有强大的增殖能力,且不违背伦理道德被广。分别植于 Transwell/小室共培养系统中,下室植人 BMSCS,上 泛用于科研与临床-。陈肖等将分离的BNSC接种室植入AF细胞,以建立2种细胞间接共培养模型,从而探 于创伤弧菌脓毒症模型小鼠探讨其对创伤弧菌脓毒症肺讨了共培养体系对AF细胞增殖和细胞外基质合成的影响 损伤的作用,发现BMSC能降低炎性因子水平并减轻肺损以及 BMSCs是否具有向AF细胞分化的能力。 Holownia等21 伤。虽然直接接触共培养操作简单,但其难度在于对指标的将烟雾处理过的单核细胞株THP-1细胞置于 Transwell小 考察,因为很难用一般的方法将2种形态相同的细胞区别开室上层,肺泡上皮细胞株A549细胞置于小室下层,共培养 来,目前可以使用形态学方法检测,或者用双标免疫组化技24h,探讨香烟烟雾对共培养条件下A549和THP-1细胞的 术或原位杂交技术,或用不同的荧光标记,亦可以用2种不影响,从而得出在暴露于烟雾条件下,THP-1细胞对A549 同标记的抗体或探针进行免疫组化或杂交,以分清2种不同细胞可能有保护作用的结论, 的细胞,并可分析2种细胞之间的关系。 2.4其他间接接触共培养方法:在共培养过程中,研究者也 2间接接触共培养法 可以用现有的实验设备制作简易的共培养装置。魏会秒231 2.1条件培养基共培养法:条件培养基是用培养过一种细利用自制48孔培养板,以6孔为一个单元,先将大鼠多器官 胞的培养基培养另一种细胞,2种细胞不直接接触,而细胞原代细胞单独培养,采用在相邻两孔壁上打孔的方法使6孔 因子可以交流,其优点是可以消除目的细胞对条件细胞的影细胞培养基共享,从而构成间接共培养体系,建立了大鼠多 响,突出条件细胞对目的细胞的作用。此法简便易行,但是器官原代细胞共培养模型,并以各原代细胞单独培养作为对 时间上的不统一是不可控因素,因此严格来说,这种方法介照,探讨了不同刺激物对不同靶器官的毒性作用。李华等21 于单层细胞培养和共培养之间,是单层细胞培养与共培养之采用6孔细胞培养板和6孔悬挂式培养皿建立共培养模型
· 766 · 中华危重病急救医学 2016 年 8 月第 28 卷第 8 期 Chin Crit Care Med，August 2016，Vol.28，No.8 作用，通过检测不同细胞因子之间的关系，探讨药物的作用 机制和可能的作用靶点。细胞共培养技术一直倍受关注，主 要用于研究诱导干细胞分化［3-4］、提高代谢物产量［5］、提高 细胞生存能力、维持细胞功能和活性［6-7］、体外组织的构建 等［8］。目前，细胞共培养方法主要包括直接接触共培养、间 接接触共培养和三维细胞共培养，3 种方法的选择主要根据 共培养细胞的正常形态、研究者的目的以及研究能否方便、 顺利进行而决定。 1 直接接触共培养法 直接接触共培养是指把 2 种或 2 种以上细胞放在同一 培养体系中，使之直接接触。这种方法适用于体内邻近的组 织细胞，主要因为这些细胞在体内可通过通讯连接、封闭连 接和锚定连接等方式传递所产生的细胞因子，而直接接触式 培养可保留这些连接信息，使培养的细胞更接近体内自然状 态［9］；该方法还适用于 2 种生长状态相同的细胞，例如 2 种 贴壁细胞或 2 种悬浮细胞。这种方法的优点是操作方便， 对培养皿或培养瓶的要求较低，一般常用的细胞支持物即 可。该方法主要用于研究细胞间相互作用以及诱导细胞分 化。刘尧［10］将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）与人软骨细 胞（hACs）从人体分离培养后，接种于丝素蛋白支架上进行 直接共培养，通过苏木素 - 伊红（HE）染色技术、Ⅱ型胶原 染色技术观察细胞形态，并与在同样支持物下用诱导剂培养 的 hBMSCs，以及单纯 hACs 进行比较，发现 hBMSCs 与 hACs 直接接触共培养有利于软骨细胞外基质的产生。Watanabe 等［11］发现，在与自身骨髓间充质干细胞（BMSCs）的相互接 触共培养中，人髓核细胞生物学活性明显提高。还有研究表 明，将内皮细胞和神经干细胞直接接触共培养后，在血管内 皮生长因子的作用下，内皮细胞可以促进神经干细胞增殖， 并有向神经细胞分化的趋势［12］。 临床细胞移植治疗也可以被看作是外源细胞和自身细 胞的直接接触共培养，其中间充质干细胞因易获得、易培 养、较稳定，具有强大的增殖能力，且不违背伦理道德被广 泛用于科研与临床［13-15］。陈肖等［16］将分离的 BMSCs 接种 于创伤弧菌脓毒症模型小鼠，探讨其对创伤弧菌脓毒症肺 损伤的作用，发现 BMSC 能降低炎性因子水平并减轻肺损 伤。虽然直接接触共培养操作简单，但其难度在于对指标的 考察，因为很难用一般的方法将 2 种形态相同的细胞区别开 来，目前可以使用形态学方法检测，或者用双标免疫组化技 术或原位杂交技术，或用不同的荧光标记，亦可以用 2 种不 同标记的抗体或探针进行免疫组化或杂交，以分清 2 种不同 的细胞，并可分析 2 种细胞之间的关系。 2 间接接触共培养法 2.1 条件培养基共培养法：条件培养基是用培养过一种细 胞的培养基培养另一种细胞，2 种细胞不直接接触，而细胞 因子可以交流，其优点是可以消除目的细胞对条件细胞的影 响，突出条件细胞对目的细胞的作用。此法简便易行，但是 时间上的不统一是不可控因素，因此严格来说，这种方法介 于单层细胞培养和共培养之间，是单层细胞培养与共培养之 间的过渡。宋旆文等［17］利用这种方法观察 BMSCs 条件培 养基对神经干细胞（NSCs）分化的影响，在彻底避免了 2 种 细胞接触产生作用的情况下，观察到 NSCs 的贴壁分化，肯 定了 BMSCs 条件培养基对 NSCs 贴壁分化的积极作用，而 不依赖于 BMSCs 本身，为 BMSCs 条件培养基与 NSCs 共同 移植提供了依据。周凌等［18］以鸡胚绒毛尿囊膜模型（CAM） 作为血管生成体内模型，观察到与单层细胞培养相比，人食 管癌细胞株 Eca-9706 细胞条件培养基可显著增加人脐静脉 内皮细胞的增殖、迁移以及小管形成。 2.2 “爬片式”共培养法：“爬片式”共培养法是将细胞先 接种在处理后的玻片上，待细胞贴壁后，以一定比例放入另 一种细胞的培养皿中与其共培养。有研究者用该方法将接 种了骨髓单核细胞的玻片或骨片置入提前 24 h 接种了成骨 细胞的培养皿中进行共培养，结果显示，成骨细胞对破骨细 胞的调控作用显著，诱导的破骨细胞具有噬骨能力，成功建 立了共培养模型，用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控 作用研究［19］。 2.3 嵌入式细胞共培养法（Transwell 小室）：嵌入式共培养 法又称“筏式”培养法或 Transwell 共培养体系，是指将带有 聚碳酯（PC）、聚酯（PET）或胶原包被的聚四氟乙烯（PTFE） 膜的 Transwell小室放在相应的培养板上建立的共培养体系。 Transwell 小室底部的膜将上下层细胞分开，膜的直径小于 3.0 μm，一般为 0.4 μm，细胞不能自由通过此膜，但细胞因子 可以自由通过，两者可通过此膜进行信息交流。嵌入式细胞 共培养法是目前应用最多的方法。这种间接共培养法可用 于各种生长状态的细胞，其优点是便于分离 2 种细胞，可更 好地观察其各自的细胞状态变化，以探讨一种细胞对另一种 细胞的作用。Cao 等［20］采用 Transwell 小室共培养处理过的 内皮细胞和上皮细胞，探讨了多壁碳纳米管棕榈酸在心血管 疾病中的作用。张明［21］通过分离、培养人纤维环（AF）细胞 与 BMSCs，分别吸取第 3 代 AF 细胞和 BMSCs，按 1：1 比例 分别植于 Transwell 小室共培养系统中，下室植入 BMSCs，上 室植入 AF 细胞，以建立 2 种细胞间接共培养模型，从而探 讨了共培养体系对 AF 细胞增殖和细胞外基质合成的影响， 以及 BMSCs 是否具有向 AF 细胞分化的能力。Holownia 等［22］ 将烟雾处理过的单核细胞株 THP-1 细胞置于 Transwell 小 室上层，肺泡上皮细胞株 A549 细胞置于小室下层，共培养 24 h，探讨香烟烟雾对共培养条件下 A549 和 THP-1 细胞的 影响，从而得出在暴露于烟雾条件下，THP-1 细胞对 A549 细胞可能有保护作用的结论。 2.4 其他间接接触共培养方法：在共培养过程中，研究者也 可以用现有的实验设备制作简易的共培养装置。魏会秒 ［23］ 利用自制 48 孔培养板，以 6 孔为一个单元，先将大鼠多器官 原代细胞单独培养，采用在相邻两孔壁上打孔的方法使 6 孔 细胞培养基共享，从而构成间接共培养体系，建立了大鼠多 器官原代细胞共培养模型，并以各原代细胞单独培养作为对 照，探讨了不同刺激物对不同靶器官的毒性作用。李华等［24］ 采用 6 孔细胞培养板和 6 孔悬挂式培养皿建立共培养模型
中华危重病急救医学2016年8月第28卷第8期 Chin crit care med, August2016.Vdl28,No8 767· 将人脐带间充质干细胞及人肝细胞株LO2细胞共培养,发越来越多的人使用。然而,随着方法的不断改进,更加接近 现在此条件下,人脐带间充质干细胞可以分化为肝样细胞。人体的多种细胞共培养体系,甚至模拟人体内循环的体外模 3三维共培养体系 型也会慢慢进入实验室,为科研与临床服务。 在动物体内,细胞实际上存在于三维生长环境中,因此,参考文献 建立三维结构共培养平台日益受到研究者的青睐,目前多选「1]谷鸿喜,张凤民,凌虹.细胞培养技术圓,北京:北京大学医 用微结构或生物降解材料创造三维共培养微环境 学出版社,2012 Gu Hx, Zhang FM. Ling H. Cell culture technique [M. Beijing: 有研究表明:利用三维支架将神经细胞和成纤维细胞 Peking University Medical Press, 2012 共培养,发现其在修复神经损伤方面具有很好的效果 [2]翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学[M北京:高等教育出 Veiga等1发现,与单层培养比较,将内皮细胞和神经干细 Zhai ZH, Wang XZ. Ding MX. Cytobiology [M Beijing Higher 胞接种在三维支架上共培养更有利于神经干细胞的增殖及 Education Press. 2011 向其分化。郝媛媛{21采用具有良好生物相容性和高度透3] Rehelo SP,Cta, Silva mm. et al. Three- dimensional co 气性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)构建微流控芯片共培养平 f human hepatocytes and mesenchym ells: improve functionality in long-term bioreactor cultures J/OL]. J Tissue 台,用于肺癌化疗耐药研究,证明了肺癌细胞与肿瘤间质成 EngRegenMed.20152015-11-15.http://www.ncbinim.nih. 纤维细胞对抗肿瘤药物VP-16的耐药与葡萄糖调节蛋白78 go/pubmed/2651 1086 published online ahead of print October 29, (GRP8)上调有关。有研究者采用微流控芯片共培养体系 2015DO:10.1002cm.2099 [4]Song K, Li W, Wang H, et al. Investigation of coculture of human 共培养膀胱肿瘤细胞和成纤维细胞,以观察膀胱肿瘤细胞 的能量代谢。Avei等应用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 Biotechnol.2012.167(8):2381-2387.DO:10.1007/s12010-012- 9764-v ( PEGDA)建立三维Mmw球状体模型,以研究胶质母细/(5]王义,杨品,孙春玉,等人参与胡萝卜混合培养物的代谢 胞瘤(GBM)的恶化机制,并取得了良好成效。 物研究食品科学,2008,29(2:126-129.DO:10.3321 4细胞共培养在中医药方面的研究 jisn.1002-6630.200802021 细胞共培养方法在探讨中医药作用机制方面也起着不 Wang Y. Yang J, Sun CY, et al. Study on metabolite of suspension nd daucus carota [J] Food Sci 可替代的作用,中药多成分复杂,可从多个层面作用于多个 2008,29(2:126-129.DOl:10.3321/jisn.1002-6630.200802 靶点。因此,在研究中药作用机制方面,单层细胞难以满足 需求,而共培养可以建立更接近内环境的模型,为揭示中药 [6]Li JW. Guo XL He CL, et al. In vitro chondrogenesis of the bone hymal stem cells directed by chondrocvtes 细胞共培养建立血脑屏障()药物选模发现好参A1、:空)四mmm 作用机制及药理、毒理提供技术平台。原江锋等将人脐 in monolayer and 3-dimetional indirect co-culture system [J) 1,124(19):3080-3086.DO:10.3760 巴细胞和人永生化表皮细胞株 HacaT细胞共培养建立慢性 J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2012. 32(2) 173-180.DO:10.1007/s11596-012-0031-9 湿疹细胞模型,以进行慢性湿疹的药效学实验和药物筛选 [8]Bersini S. Gilardi M, Arrigoni C, et al. Human in vitro 3D 并取得很好的效果。还有研究者通过建立肿瘤相关的人巨 co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking 噬细胞株TAMs细胞与人子宫内膜癌细胞株 Ishikawa细胞 approach [). Biomaterials, 2016, 76: 157-172. DOl: 10.1016/ 共培养模型,研究白花蛇舌草黄酮和多糖对共培养体系的一1m20150 影响发现白花蛇舌草黄酮能抑制细胞产生白细胞介素-100[9]詹秀琴,菱泽群,干细胞共培养技术在医学研究中的应 (IL-10),阻断细胞核转录因子-KBp65(NF-KBp65)信号通 路的表达,从而抑制与TAMs细胞共培养的 Ishikawa细胞增 Zhan XQ. Jiang zQ. Cell co-culture technique in the medical 殖2]。但该方法在中医药方面的应用还存在一定的局限性, research of stem cells J Chin J Cell Biol. 2014, 36(8):1178- 1185.DOl:10.11844ejch201408.0027 多采用二维培养体系,不能完全模拟人体多细胞相互作用的[10]刘尧共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究l 内环境。因此,建立多细胞共培养的体外模型将为中医药研 苏州:苏州大学.2014 究提供新的技术支持。中药在临床及科研中多以复方的形 Liu Y. The experimental study of co-culture technology for the 式出现,复方制剂直接加入到培养体系中,会受制剂的杂质 construction of engineered cartilage in vitro [D). Suzhou: Coochow pH值、渗透压等影响,含药血清代替中药复方可以大幅[11] Watanabe T. Sakai d. Yamamoto y,etal. Human nucleus 度降低这些影响。 pulposus cells significantly enhanced biological properties in a 综上所述,细胞共培养法越来越多地被研究者使用,也 coculture system with direct cell-to-cell contact with autologous mesenchymal stem cells [J]J Orthop Res, 2010, 28(5): 623-630 不断被改进、更新,使之更利于研究。在二维共培养体系中 Transwell小室共培养体系因操作简单,便于观察细胞形态变12]sm.hnw,MaD.cra. Endothelial cells promote neural stem 化而被广泛应用。支架、芯片等构成的三维共培养体系可 cell proliferation and differentiation associated with VEGF activated Notch and Pten signaling [J]. Dev Dyn, 2010, 239(9): 2345-2353. 以为细胞提供更充分的生长环境,更接近人体解剖结构,被 DOl:10.1002/dvdy2237
中华危重病急救医学 2016 年 8 月第 28 卷第 8 期 Chin Crit Care Med，August 2016，Vol.28，No.8 · 767 · 将人脐带间充质干细胞及人肝细胞株 LO2 细胞共培养，发 现在此条件下，人脐带间充质干细胞可以分化为肝样细胞。 3 三维共培养体系 在动物体内，细胞实际上存在于三维生长环境中，因此， 建立三维结构共培养平台日益受到研究者的青睐，目前多选 用微结构或生物降解材料创造三维共培养微环境。 有研究表明：利用三维支架将神经细胞和成纤维细胞 共培养，发现其在修复神经损伤方面具有很好的效果［24-25］。 Veiga 等［26］发现，与单层培养比较，将内皮细胞和神经干细 胞接种在三维支架上共培养更有利于神经干细胞的增殖及 向其分化。郝媛媛［27］采用具有良好生物相容性和高度透 气性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建微流控芯片共培养平 台，用于肺癌化疗耐药研究，证明了肺癌细胞与肿瘤间质成 纤维细胞对抗肿瘤药物 VP-16 的耐药与葡萄糖调节蛋白 78 （GRP78）上调有关。有研究者采用微流控芯片共培养体系 共培养膀胱肿瘤细胞和成纤维细胞，以观察膀胱肿瘤细胞 的能量代谢［28］。Avci 等［29］应用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 （PEGDA）建立三维 Microwells 球状体模型，以研究胶质母细 胞瘤（GBM）的恶化机制，并取得了良好成效。 4 细胞共培养在中医药方面的研究 细胞共培养方法在探讨中医药作用机制方面也起着不 可替代的作用，中药多成分复杂，可从多个层面作用于多个 靶点。因此，在研究中药作用机制方面，单层细胞难以满足 需求，而共培养可以建立更接近内环境的模型，为揭示中药 作用机制及药理、毒理提供技术平台。原江锋等［30］将人脐 静脉内皮细胞株 ECV304 细胞与大鼠神经胶质瘤细胞株 C6 细胞共培养建立血脑屏障（BBB）药物筛选模型，发现丹参 提取液中有多于 16 种成分可以穿过 BBB。刘学伟［31］用淋 巴细胞和人永生化表皮细胞株 HaCaT 细胞共培养建立慢性 湿疹细胞模型，以进行慢性湿疹的药效学实验和药物筛选， 并取得很好的效果。还有研究者通过建立肿瘤相关的人巨 噬细胞株 TAMs 细胞与人子宫内膜癌细胞株 Ishikawa 细胞 共培养模型，研究白花蛇舌草黄酮和多糖对共培养体系的 影响，发现白花蛇舌草黄酮能抑制细胞产生白细胞介素 -10 （IL-10），阻断细胞核转录因子 -κB p65（NF-κB p65）信号通 路的表达，从而抑制与 TAMs 细胞共培养的 Ishikawa 细胞增 殖［32］。但该方法在中医药方面的应用还存在一定的局限性， 多采用二维培养体系，不能完全模拟人体多细胞相互作用的 内环境。因此，建立多细胞共培养的体外模型将为中医药研 究提供新的技术支持。中药在临床及科研中多以复方的形 式出现，复方制剂直接加入到培养体系中，会受制剂的杂质、 pH 值、渗透压等影响［33］，含药血清代替中药复方可以大幅 度降低这些影响。 综上所述，细胞共培养法越来越多地被研究者使用，也 不断被改进、更新，使之更利于研究。在二维共培养体系中， Transwell 小室共培养体系因操作简单，便于观察细胞形态变 化而被广泛应用。支架、芯片等构成的三维共培养体系可 以为细胞提供更充分的生长环境，更接近人体解剖结构，被 越来越多的人使用。然而，随着方法的不断改进，更加接近 人体的多种细胞共培养体系，甚至模拟人体内循环的体外模 型也会慢慢进入实验室，为科研与临床服务。 参考文献 ［1］ 谷鸿喜 , 张凤民 , 凌虹 . 细胞培养技术 [M]. 北京 : 北京大学医 学出版社 , 2012. Gu HX, Zhang FM, Ling H. Cell culture technique [M]. Beijing: Peking University Medical Press, 2012. ［2］ 翟中和 , 王喜忠 , 丁明孝 . 细胞生物学 [M]. 北京 : 高等教育出 版社 , 2011. Zhai ZH, Wang XZ, Ding MX. Cytobiology [M]. Beijing: Higher Education Press, 2011. ［3］ Rebelo SP, Costa R, Silva MM, et al. Three-dimensional co-culture of human hepatocytes and mesenchymal stem cells: improved functionality in long-term bioreactor cultures [J/OL]. J Tissue Eng Regen Med, 2015 [2015-11-15]. http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/26511086 [published online ahead of print October 29, 2015]. DOI: 10.1002/term.2099. ［4］ Song K, Li W, Wang H, et al. Investigation of coculture of human adipose-derived stem cells and mature adipocytes [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2012, 167 (8): 2381-2387. DOI: 10.1007/s12010-012- 9764-y. ［5］ 王义 , 杨晶 , 孙春玉 , 等 . 人参与胡萝卜混合培养物的代谢 产物研究 [J]. 食品科学 , 2008, 29 (2): 126-129. DOI: 10.3321/ j.issn.1002-6630.2008.02.021. Wang Y, Yang J, Sun CY, et al. Study on metabolite of suspension co-culture with panax ginseng and daucus carota [J]. Food Sci, 2008, 29 (2): 126-129. DOI: 10.3321/j.issn.1002-6630.2008.02. 021. ［6］ Li JW, Guo XL, He CL, et al. In vitro chondrogenesis of the goat bone marrow mesenchymal stem cells directed by chondrocytes in monolayer and 3-dimetional indirect co-culture system [J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124 (19): 3080-3086. DOI: 10.3760/ cma.j.issn.0366-6999.2011.19.024. ［7］ Zhang B, Yang S, Zhang Y, et al. Co-culture of mesenchymal stem cells with umbilical vein endothelial cells under hypoxic condition [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2012, 32 (2): 173-180. DOI: 10.1007/s11596-012-0031-9. ［8］ Bersini S, Gilardi M, Arrigoni C, et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach [J]. Biomaterials, 2016, 76 : 157-172. DOI: 10.1016/ j.biomaterials.2015.10.057. ［9］ 詹秀琴 , 姜泽群 . 干细胞共培养技术在医学研究中的应 用 [J]. 中国细胞生物学学报 , 2014, 36 (8): 1178-1185. DOI: 10.11844/cjcb.2014.08.0027. Zhan XQ, Jiang ZQ. Cell co-culture technique in the medical research of stem cells [J]. Chin J Cell Biol, 2014, 36 (8): 1178- 1185. DOI: 10.11844/cjcb.2014.08.0027. ［10］ 刘尧 . 共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究 [D]. 苏州 : 苏州大学 , 2014. Liu Y. The experimental study of co-culture technology for the construction of engineered cartilage in vitro [D]. Suzhou: Coochow University, 2014. ［11］ Watanabe T, Sakai D, Yamamoto Y, et al. Human nucleus pulposus cells significantly enhanced biological properties in a coculture system with direct cell-to-cell contact with autologous mesenchymal stem cells [J]. J Orthop Res, 2010, 28 (5): 623-630. DOI: 10.1002/jor.21036. ［12］ Sun J, Zhou W, Ma D, et al. Endothelial cells promote neural stem cell proliferation and differentiation associated with VEGF activated Notch and Pten signaling [J]. Dev Dyn, 2010, 239 (9): 2345-2353. DOI: 10.1002/dvdy.22377
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