（6-BA）的培养基上诱导愈伤组织形成，用封口膜将培养皿封好。 （4）在恒温培养箱中，26℃下,培养六周，形成愈伤组织，经继代后，可用于生根培养 实验三 酵母菌细胞融合实验 一、实验目的 学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定 基础。 二、实验原理 酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随 着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术 都有了突破性的进展。作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。这种经 溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母 体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。 这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。 本实验以酿酒酵母为材料，进行原生质体的分离制备和再生。酵母菌原生质体的制备一 般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。分离制备过程受许多因素的影响，如不 同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。所以整个实验过程设 计应综合考虑各种因素，才能获得较好的效果。分离制备的原生质体在适当的再生培养基上 培养时，可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态，即完成再生过程，这也是以原生质体为受 体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。 在原生质体制备中，应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。一般来说，对数生长 期的酵母菌细胞易脱壁，静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。而不同菌种的生长对数 期也略有差异，一般在 12～16 小时之间（108 细胞/ml）。制成的原生质体悬浮液在 0℃条 件下保存 4～6 小时，不会影响融合再生率。所以欲进行原生质体融合，应在制备后尽快进 行，以免时间过长，影响再生。 分离过程中采用的β-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏，使蜗牛酶易于分解细 胞壁。此外，渗透压的调节可用 0.8mol/L 山梨醇、16％蔗糖，或者 0.6mol/L KCl 溶液