三、实验材料 菌种：酿酒酵母 SP-48、L-酵母： 器具和试剂： 恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。 液体 YEPD：1000 ml 分装四瓶（蛋白胨 2% 葡萄糖 2% 酵母浸膏 1% 自然 pH 值） 高渗 YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液体培养基中加入 2%琼脂 PB：2000 ml 柠檬酸：21 克溶于 1000 毫升蒸馏水中 磷酸氢二钠：143.256 克溶于 2000 毫升蒸馏水中 取柠檬酸溶液 678 毫升 取磷酸氢二钠溶液 1322 毫升 混合得 2000 毫升 PB 高渗 PB：取 1000 毫升 PB 加入 KCL52.185 克 PEG-CaCl：聚乙二醇 6000 40 克 加入至 100 毫升高渗 PB 溶液中 使氯化钙为 0.4mol/l 0.2%β-巯基乙醇，无菌过滤器过滤. 蜗牛酶液:1.5% 蜗牛酶用高渗 PB 缓冲溶液配制，无菌过滤器过滤. 淀粉 YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液体培养基中加入 2%琼脂（蛋白胨 2% 淀粉 2% 酵母浸膏 1% 自然 pH 值） 四、实验步骤 整个分离制备和再生过程于无菌条件下操作。 1.原生质体的制备: (1) 菌种培养:将酵母菌 sp-48 和 L-酵母活化转接新鲜斜面.自新鲜斜面分别挑取一环 sp-48 酵母和 L-酵母转接入 250ml 完全培养基中,30℃振荡培养 16-18h. (2) 收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液 5ml,4000r/min 离心 10min，弃上清液. 柠檬酸-磷酸缓冲液(PB)洗两次，收集菌体 (3) 预处理：取 5ml0.2%β-巯基乙醇 PB 缓冲液于装有酵母泥的离心管中,30℃保温 10min, 以 1000 转/分离心 10min,倾去上清液 (4) 脱壁：在装有处理过的 SP－48,L-酵母菌泥的两只离心管中，分别加入 5ml 1.5%蜗牛酶三、实验材料 菌种：酿酒酵母 SP-48、L-酵母： 器具和试剂： 恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。 液体 YEPD：1000 ml 分装四瓶（蛋白胨 2% 葡萄糖 2% 酵母浸膏 1% 自然 pH 值） 高渗 YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液体培养基中加入 2%琼脂 PB：2000 ml 柠檬酸：21 克溶于 1000 毫升蒸馏水中 磷酸氢二钠：143.256 克溶于 2000 毫升蒸馏水中 取柠檬酸溶液 678 毫升 取磷酸氢二钠溶液 1322 毫升 混合得 2000 毫升 PB 高渗 PB：取 1000 毫升 PB 加入 KCL52.185 克 PEG-CaCl：聚乙二醇 6000 40 克 加入至 100 毫升高渗 PB 溶液中 使氯化钙为 0.4mol/l 0.2%β-巯基乙醇，无菌过滤器过滤. 蜗牛酶液:1.5% 蜗牛酶用高渗 PB 缓冲溶液配制，无菌过滤器过滤. 淀粉 YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液体培养基中加入 2%琼脂（蛋白胨 2% 淀粉 2% 酵母浸膏 1% 自然 pH 值） 四、实验步骤 整个分离制备和再生过程于无菌条件下操作。 1.原生质体的制备: (1) 菌种培养:将酵母菌 sp-48 和 L-酵母活化转接新鲜斜面.自新鲜斜面分别挑取一环 sp-48 酵母和 L-酵母转接入 250ml 完全培养基中,30℃振荡培养 16-18h. (2) 收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液 5ml,4000r/min 离心 10min，弃上清液. 柠檬酸-磷酸缓冲液(PB)洗两次，收集菌体 (3) 预处理：取 5ml0.2%β-巯基乙醇 PB 缓冲液于装有酵母泥的离心管中,30℃保温 10min, 以 1000 转/分离心 10min,倾去上清液 (4) 脱壁：在装有处理过的 SP－48,L-酵母菌泥的两只离心管中，分别加入 5ml 1.5%蜗牛酶