-PB 溶液置 30℃水浴中处理,取样镜检,当 80%以上的细胞转变为原生质体 2500r/min 离心 10min,用 PB 液离心洗涤，洗去酶液，加入 4ml 高渗 PB 液制成 106 /ml 以上的原生 质体液,测定形成率 原生质体形成率=(酶解前菌落计数-未形成原生质体菌数)/ 酶解前菌落计数×100% 2.原生质体再生率测定 : 将制备的原生质体稀释到2-3×107 个/ml,各取1ml原生质体液用PB液稀释后涂布在高 渗完全培养基（YEPDS）和完全培养基(YEPD).30℃培养 2 天计算菌落数,酶解前的菌液直接 用无菌水稀释涂布完全培养基，培养后计算菌数。 原生质体再生率％＝ 100% − − 酶解前总菌数 未形成原生质体菌数 再生平板得总菌数 未形成原生质体菌数 3.原生质体的融合: (1). 将 L-酵母的原生质体用紫外线灭活 2 分钟,在黑暗中保存 20 分钟, 2500rad/min 离心 10min,用 2ml 高缓冲液悬浮. (2). 将两菌的原生质体悬浮液混合,离心,向沉淀中加入 3mlPEG-CaCl2,振荡均匀, 30℃处理 20min, 镜检并观察融合情况. (3). 用高深缓冲液洗涤菌体沉淀, 2500rad/min 离心 10min. (4). 立即用高深缓冲液稀释,取融合原菌液及 10-1 稀释液各 0.1ml 菌液,涂布于再生培 养基平板上. 4.融合子的检出: 将融合液涂布在加有 0.01%的放线菌酮和青霉素(100IU/ml)的再生培养基上,30℃进行 培养 2 天,计算融合率. 融合率= 完全培养基平板上再生原生质体数 融合子 ×100% 五、实验结果 1.融合子的鉴定 : 观察比较两亲株和融合子的细胞形态 2.计算两亲本原生质体的形成率和再生率 3.计算融合率-PB 溶液置 30℃水浴中处理,取样镜检,当 80%以上的细胞转变为原生质体 2500r/min 离心 10min,用 PB 液离心洗涤，洗去酶液，加入 4ml 高渗 PB 液制成 106 /ml 以上的原生 质体液,测定形成率 原生质体形成率=(酶解前菌落计数-未形成原生质体菌数)/ 酶解前菌落计数×100% 2.原生质体再生率测定 : 将制备的原生质体稀释到2-3×107 个/ml,各取1ml原生质体液用PB液稀释后涂布在高 渗完全培养基（YEPDS）和完全培养基(YEPD).30℃培养 2 天计算菌落数,酶解前的菌液直接 用无菌水稀释涂布完全培养基，培养后计算菌数。 原生质体再生率％＝ 100% − − 酶解前总菌数 未形成原生质体菌数 再生平板得总菌数 未形成原生质体菌数 3.原生质体的融合: (1). 将 L-酵母的原生质体用紫外线灭活 2 分钟,在黑暗中保存 20 分钟, 2500rad/min 离心 10min,用 2ml 高缓冲液悬浮. (2). 将两菌的原生质体悬浮液混合,离心,向沉淀中加入 3mlPEG-CaCl2,振荡均匀, 30℃处理 20min, 镜检并观察融合情况. (3). 用高深缓冲液洗涤菌体沉淀, 2500rad/min 离心 10min. (4). 立即用高深缓冲液稀释,取融合原菌液及 10-1 稀释液各 0.1ml 菌液,涂布于再生培 养基平板上. 4.融合子的检出: 将融合液涂布在加有 0.01%的放线菌酮和青霉素(100IU/ml)的再生培养基上,30℃进行 培养 2 天,计算融合率. 融合率= 完全培养基平板上再生原生质体数 融合子 ×100% 五、实验结果 1.融合子的鉴定 : 观察比较两亲株和融合子的细胞形态 2.计算两亲本原生质体的形成率和再生率 3.计算融合率