下，以防止DNA损伤。 3.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高 DNA的回收率。 4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μl进行 计算。 5.向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer,DR-Buffer的加量如下表： 凝胶浓度DR-I Buffer使用量 10% 3个凝胶体积量 1.0%~1.5% 4个凝胶体积量 1.5%一2.0%5个疑胶体积量 6.均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加 热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。注：胶块 定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 7.向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的l/2体积量的DR-II Buffer, 均匀混合。当分离小于4O0bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。 8.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube.上。 9.将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12.000rpm离心l分 钟，弃滤液。（注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA 的回收率。 10.将500μ的Rinse A加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟， 弃滤液。 1l.将700μ1的Rinse B加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒钟 弃滤液。 12.重复操作步骤11。 l3.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中 央处加入25μI的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟。注：把灭菌 蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 14.12,000rpm离心1分钟洗DNA。 注意事项： 1.纯化的DNA用于DNA序列分析时，最好使用灭菌蒸馏水洗脱DNA。 2.DNA需长期保存时，建议在Elution Buffer中保存。 3.长片段DNA回收时应该注意哪些问题？ 当DNA片段长度较长(5kbp以上)时，回收效率会有所下降，这是DNA切 胶回收时的常见现象。此时建议按以下方法解决问题： ①适当增加待回收DNA样品的添加量（如起始量加至2~5μg)。 ②由于长片段DNA不易从滤膜上洗脱下来，建议使用加热至60℃的 Elution Buffer洗脱DNA,可以提高回收效率。 17 17 下，以防止DNA损伤。 3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高 DNA的回收率。 4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1μl进行 计算。 5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表： 凝胶浓度 DR-I Buffer使用量 1.0％ 3个凝胶体积量 1.0％～1.5％ 4个凝胶体积量 1.5％～2.0％ 5个凝胶体积量 6. 均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加 热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6~10分钟）。 注：胶块一 定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer， 均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。 8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分 钟，弃滤液。（注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA 的回收率。 10. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟， 弃滤液。 11. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟， 弃滤液。 12. 重复操作步骤11。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中 央处加入25 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 注：把灭菌 蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 14. 12,000 rpm离心1分钟洗DNA。 注意事项： 1. 纯化的DNA用于DNA序列分析时，最好使用灭菌蒸馏水洗脱DNA。 2. DNA需长期保存时，建议在Elution Buffer中保存。 3. 长片段DNA回收时应该注意哪些问题？ 当DNA片段长度较长（5 kbp以上）时，回收效率会有所下降，这是DNA切 胶回收时的常见现象。此时建议按以下方法解决问题： ① 适当增加待回收DNA样品的添加量（如起始量加至2~5 μg）。 ② 由于长片段DNA不易从滤膜上洗脱下来，建议使用加热至60℃的 Elution Buffer洗脱DNA， 可以提高回收效率