实验六DNA片段的回收与纯化 一、实验目的 掌握DNA片段回收的原理及方法 二、实验原理 质粒、噬菌体等经酶切后电泳，PCR产物经电泳后，常常需要对这些 DNA电泳后的片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收 和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒， 三、 实验用品 (一)仪器：电泳槽、泳仪、紫外灯、离心机。 (二)试剂：1×TE、琼脂糖（低融点琼脂糖）、Ts-HC饱和酚(pH 7.6)、3 M NaAc(pH5.2)、无水乙醇、TE、氯仿、异戊醇。 四、实验内容与方法 (一)冻融法 1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g) 捣碎，置于1.5mL离心管中： 2. 加入等体积的Tis-HC饱和酚(pH7.6),振荡混匀： 3. 20℃放置5-10min 4.4℃离心10000g×5min,上层液转移置另一离心管中： 5.加入1/4体积H0于含胶的离心管中，振荡混匀： 6.-20℃，放置5-10min: 7.4℃离心10000g×5min,合并上清液 8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清： 9. 加入1/10体积3 M NaAc(pH5.2、25倍体积预冷的无水乙醇，混 匀： 10.-20℃，静置30min: 11.4℃离心13000g×10min,弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾千： 12.加适量H0或TE溶解沉淀。 (二)胶回收试剂盒 1.使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进 行琼脂糖凝胶电泳。 2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面 的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体 积，提高DNA回收率。（注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯16 实验六 DNA 片段的回收与纯化 一、 实验目的 掌握 DNA 片段回收的原理及方法 二、 实验原理 质粒、噬菌体等经酶切后电泳，PCR 产物经电泳后，常常需要对这些 DNA 电泳后的片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA 回收 和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒。 三、 实验用品 （一） 仪器：电泳槽、泳仪、紫外灯、离心机。 （二） 试剂：1×TAE、琼脂糖（低融点琼脂糖）、Tris-HCl 饱和酚（pH 7.6）、3M NaAc（pH 5.2）、无水乙醇、TE、氯仿、异戊醇。 四、 实验内容与方法 （一）冻融法 1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g） 捣碎，置于 1.5mL 离心管中； 2. 加入等体积的 Tris-HCl 饱和酚（pH 7.6），振荡混匀； 3. -20℃放置 5~10min； 4. 4℃离心 10000g×5min，上层液转移置另一离心管中； 5. 加入 1/4 体积 H2O 于含胶的离心管中，振荡混匀； 6. -20℃，放置 5~10min； 7. 4℃离心 10000g×5min，合并上清液； 8. 用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清； 9. 加入 1/10 体积 3M NaAc（pH 5.2）、2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混 匀； 10. -20℃，静置 30min； 11. 4℃离心 13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀 1-2 次，晾干； 12. 加适量 H2O 或 TE 溶解沉淀。 （二）胶回收试剂盒 1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进 行琼脂糖凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面 的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体 积，提高DNA回收率。（注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯