212 上海水产大学学报 7卷 供减毒研究用 1.3药物 在野外采集的细叶核树叶,用自来水洗净,室内凉干。称10克老叶并剪成小片,用双蒸水 100mL煮沸约2分钟,纱布过滤。补足失去的水分,得10%桉叶药液(下称核液)。再经10磅高压 蒸气消毒30分钟,置4℃冰箱备用,此即为试验原液用时加培养液稀释至所需浓度 1.4892株减毒过程观察 取长成致密单层的PSF细胞,用0,25%胰蛋白酶和002%乙二胺四乙酸二钠混合消化液 消化约1分钟,倒掉消化液,加入培养液,用吸管吹打使细胞分散,然后加入除菌组织病毒液,使 病毒最终浓度为1500分装入细胞瓶(细胞浓度1.5×10个/mL)置28℃培养2~3天细胞长 成致密单层镜检PSF细胞无产生病变。根据出血病病毒感染草鱼后,草鱼的发病时间为1周 左右,因而8~10天收获。收获后的细胞病毒液置-70℃保存,作为试验用的细胞毒种 (1)在PSF细胞培养液中加入桉液,使桉浓度分别为1:100、1x200、1:500、1:1000、 1:5000,110000每一试验(浓度)组和对照组各分装4瓶细胞,置28℃培养连续观察96小时, 每隔24小时镜检并记录细胞生长情况 (2在细胞传代和接入病毒的同时,在各组培养液中加入桉液(病毒的最终浓度为1:20) 使它们含桉的浓度分别为111000、1:5000、1:1000,0置28℃培养8~10天收获,并置-30℃冰 结融化后的细胞病毒液用0.65%生理盐水稀释10倍,以每尾0.2mL接种草鱼种。观察15天, 检查892株在上述三种桉液浓度作用下的毒力变化 (3)通过对草鱼感染试验证实892株在上述三种桉液浓度作用下都能正常增殖后,按上述 接种病毒的方法在PSF细胞中连续继代驯化每隔5~7代将收获的细胞病毒液用0.65%生理 盐水稀释102倍,以每尾0.2mL剂量接种草鱼。检查892株在不同浓度核液作用下的减毒效果 (4)将桉液稀释度为11000的组在PSF细胞中继续传代驯化,并将每一代的细胞病毒液 按上述方法进行检查,观察桉液对892株的减毒效果。 (5)经核液作用减毒的892株传至2?代后,不再加入核液,继续传至37代。观察致弱病毒的 安全性和免疫原性 (6观察用89225~2?代制备的冻干弱毒疫苗对草鱼的安全性和免疫原性 1.5试验鱼 试验用鱼为全长9~12cm的当年草鱼种,在水泥池暂养期间用药物杀灭体表及鳃的寄生 虫和细菌等病原体,确保鱼体健康 各试验组和对照组的鱼数均为每组10尾。 2结果 21桉液对PSF细胞生长的影响 结果见表1由表1可知前三种核液浓度的毒性较大,影响细胞正常生长。而后三种浓度对上 海 水 产 大 学 学 报 7卷 供减毒研究用 。 1．3 药物 在野 外 采集 的细叶桉 树 叶 ，用 自来水 洗净 ，室 内凉干 。称10克老 叶并 剪成 小片 ，用双 蒸水 lOOmL煮沸约2分钟 ，纱布过滤 。补足失 去的水分 ，得1O 桉 叶药液 (下称桉 液)。再经 1O磅高压 蒸气 消毒3吩 钟 ，置 4℃冰箱 备用 ，此 即为试验原液 。用时加培养液 稀释 至所需浓度 。 1．4 892株减毒过程观察 取长成致 密单 层的 PSF细胞 ，用0．25 胰 蛋 白酶和 0．02 乙二胺 四乙酸 二钠混合 消化液 消化约 1分钟 ，倒 掉消化 液 ，加入 培养 液 ，用 吸管 吹打 使细胞分 散 ，然后 加入 f棠菌组织病 毒液 ，使 病毒 最终 浓度 为1；500。分装入 细胞 瓶 (细胞浓度1．5×10个／rim )。128"C培养 。2～3天 细胞长 成致 密单 层 。镜检 PSF细 胞无产生病变 。根据 出血病病毒感 染草 鱼后 ，草鱼的发病 时 间为1周 左右 ，因而8～10天收获 。收获后 的细胞病毒液置 一7O℃保存 ，作为试验用 的细胞毒种 。 (1)在 PSF细 胞培 养 液 中加 入 桉 液 ，使 桉 浓 度 分 别 为 1 100、1t200、1：500、1：1000、 15000、1；10000。每一试验 (浓度 )组和 对照组 各分 装4瓶 细胞 ，置 28I]培养 。连 续观察 96小时 ， 每隔24小时镜检并记录细胞生 长情况 。 (2)在细胞传代和接 入病毒 的同时 ，在各组培养液 中加 入桉液 (病 毒的最终浓 度为 120)， 使 它 们含 桉 的浓 度分 别为 1；1000、15000、1 10000，置 28I]培养 8～ 10天收获 一并置 一30℃冰 结 。融 化后 的细胞病毒 液用065 生理盐 水稀释 1O。倍 ，以每尾0．2mL接种草 鱼种 。观察 15天 ， 检查892株在 上述 三种桉液浓度作用下 的毒力变 化 。 (3)通过对草 鱼感 染试验证 实892株在上述三种桉 液浓度 作用下都 能正常增 殖后 ，按上述 接种病毒的方法在 PSF细胞中连 续继代 驯化 。每隔 5～7代将 收获 的细胞病 毒 液用0．65 生理 盐水稀释1O。倍 ，以每 尾0．2mL剂 量接 种草鱼 检查 892株 在不同浓度桉 液作用下的减毒效果 (4)将桉 液稀释度 为1 1000的组在 PSF细 胞中继续传代 驯 化 ，并将 每一代 的细胞病 毒液 按 上述 方法进行检查 ，观察桉液对892株的减毒效果 。 (5)经桉液作用减 毒的892株传 至27代 后 ，不再加入桉 液 ，继 续传 至37代 。观察 致弱病毒 的 安全性和 免疫原性 。 (6)观察 甩892株25~27代制备 的冻干弱毒疫苗对草 鱼的安全性 和免疫原性 1．5 试验鱼 试验用鱼为 全长9~12cm 的 当年 草鱼种 ，在水 泥池暂养 期间 用药物杀灭 体 表及 鳃的 寄生 虫和 细菌 等病原体 ，确保鱼体健康 。 各试验 组和对照组 的鱼数均为 每组 10尾 。 2 结 果 2．1 桉液对 PSF细胞生长的影响 结果 见表1。由表 1可知前三 种桉 液浓度 的毒性较 大 ，影 响细胞 正常生长 。而 后三种浓度 对 维普资讯 http://www.cqvip.com